Catálogo de la Colección "Derecho, Economía y Sociedad" Sitio Oficial de la Facultad de Derecho de la Universidad de Buenos Aires

Regulación jurídica de las biotecnologías

Curso dictado por la Dra. Teodora Zamudio

Equipo de docencia e investigación UBA~Derecho

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 Glosario

Investigación e implementación de sistemas de identificación de individuos por tecnicas de biologia molecular (Cap 1 y 2)


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... con especial referencia a los estudios post-mortem.

Tesista  Gustavo Adolfo Penacino.

Director: Dr. Daniel Corach.

Tesis doctoral  aprobada con Sobresaliente 11 de diciembre de 1997 Area Biologia Molecular

Universidad de Buenos Aires, Argentina.

Contacto actual con el autor: Director Unidad de Análisis de ADN, Colegio Oficial de Farmacéuticos y Bioquímicos, Rocamora 4045, Buenos Aires, Argentina. Tel/fax: (54) (11) 4862-1142. E-mail: gpenacino@wwiecorp.com. Website: www.adn.ac www.secretpaternity.com

1 Resumen

2 Introducción

2.1 Criterios convencionales de identificación humana

2.2 La identificación de individuos por técnicas bioquímicas que evaluan el fenotipo.

2.3 La identificación de individuos por técnicas bioquímicas que evalúan el genotipo: los análisis de adn.

2.4 Objetivos.

 

1 Resumen 2 Introducción 3 Materiales 4 Métodos 5 Resultados 6 Discusión 7 Conclusiones 8 Bibliografia

 

 

 

 

 

 

1 Resumen

A mediados de los ´80 comienzan a desarrollarse sistemas de identificación de individuos basados en el estudio de polimorfismos de ADN, los cuales reflejan la amplia variación de secuencias localizadas en diferentes regiones del genoma.

La variabilidad de estas zonas radica en diferencias exhibidas por el material genético, en la secuencia nucleotídica misma a través de sustituciones de nucleótidos, o en la distinta longitud generada por una misma secuencia que se repite un número diferente de veces, como fuera demostrado por primera vez por Wyman and White (1980). Comenzaron a ser estudiadas cuando fué posible conocer su localización y desarrollar una metodología adecuada para ponerlas de manifiesto, mediante sistemas de análisis cada vez más precisos y sencillos.

Los primeros trabajos, publicados a mediados de los ´80, empleaban fragmentos de ADN obtenidos por digestión con enzimas, separados electroforéticamente y transferidos a un soporte sólido, el cual se trataba con una "sonda" constituída por secuencias complementarias de las regiones variables, marcada radiactivamente. Por autorradiografía, resultaba posible observar varias bandas, de localización desconocida dentro del genoma, pero que eran características de cada individuo y se heredaban de padres a hijos (Jeffreys et al, 1985a y b).

Si bien las bandas producidas por estas sondas multilocus eran muy variables de una persona a otra, los resultados eran difícilmente reproducibles, ya que pequeñas y poco controlables diferencias en la corrida electroforética (voltaje, tiempo, concentración del gel) afectaban en gran medida la reproducibilidad e interpretación de los resultados.

El descubrimiento de regiones hipervariables del genoma con localización específica (Nakamura et al, 1987) permitió el desarrollo de las sondas de locus único que resolverían el problema, posibilitando el estudio de una zona conocida del genoma que se visualizaba como dos únicas bandas para la condición heterocigota, correspondientes cada una a un alelo, heredado de cada progenitor.

Estas zonas están constituídas por secuencias repetidas, que aparentemente carecen de función como codificantes de proteínas. La menor variabilidad exhibida por estos sistemas de análisis se solucionaba empleando un conjunto de cuatro o más sondas unilocus que evaluaban otras tantas regiones del genoma.

Sin embargo, aún persistía un inconveniente para el empleo masivo de estas metodologías en la práctica forense: las sondas multilocus, y en menor medida las unilocus, requerían un ADN en estado óptimo en cuanto a su integridad, de alto peso molecular, lo cual rara vez ocurre en cadáveres en proceso de descomposición, o en manchas antiguas de fluídos biológicos o expuestas a condiciones ambientales adversas.

La solución llegó con el desarrollo de técnicas de amplificación o "copiado" de porciones de ADN mediante la "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", con las cuales fue posible implementar sistemas de análisis de secuencias más pequeñas ("microsatélites" o "STRs"), pero menos variables que las anteriores. Con el advenimiento de esta nueva técnica, se hizo posible la evaluación de polimorfismos en cuanto a la secuencia nucleotídica de la región variable, además de las diferencias de longitud.

La permanente innovación metodológica exige la actualización y perfeccionamiento de los sistemas validados por la comunidad forense internacional, que cuenta al presente con la posibilidad de evaluar un centenar de regiones variables del genoma.

En una primera etapa, el presente trabajo consistió en el perfeccionamiento de las técnicas de extracción y purificación de ADN a partir de fluídos biológicos y sus manchas obtenidas experimentalmente, estudiándose la influencia del soporte y de la presencia de mezclas.

Posteriormente, se analizaron manchas e hisopados provenientes de casos judiciales que contenían semen y fluídos no seminales, evaluándose la eficiencia de los métodos de purificación, de las condiciones de conservación y del soporte, correlacionando los resultados con los obtenidos previamente.

En una segunda etapa, se estudiaron pelos, uñas y material cadavérico en condiciones de conservación variable, proveniente de individuos de diferente edad y sexo, a efectos de determinar los métodos de extracción de ADN más eficientes y las condiciones de conservación más adecuadas de las muestras.

El estudio de tejidos humanos provenientes de desastres en masa (atentado a la Embajada de Israel y a la mutual israelita AMIA, entre otros), permitió diseñar nuevos métodos de análisis rápido y evaluar la eficiencia de los sistemas conocidos.

Finalmente, la identificación de secuencias ubicadas en el cromosoma Y humano y su distribución intra e interpoblacional, encarada en la Argentina por nuestro grupo como parte de un estudio a nivel mundial, constituyó un importante aporte a las ciencias forenses y antropológicas.

Estos sistemas, optimizados para su análisis en reacciones "multiplex", se emplean actualmente en casos de paternidad discutida sobre un hijo varón, cuando el supuesto padre no se encuentra disponible o se niega al estudio, analizándose cualquier hombre perteneciente a la misma patrilínea que el progenitor ausente: la coincidencia de las secuencias variables del cromosoma Y será total, de existir el vínculo biológico.

Resultan además de gran utilidad en el estudio de evidencias provenientes de delitos sexuales, donde puede establecerse el patrón genético del emisor del semen sin la habitual contaminación con el ADN de la víctima.

Este trabajo constituye un modesto aporte científico a la resolución de necesidades sociales encuadradas en el ámbito de la Justicia Civil y Criminal.

En su conjunto, el desarrollo de nuevas metodologías de análisis que hacen posible la identificación de individuos, restos humanos y rastros biológicos, constituye una nueva y valiosa herramienta forense.

 

2 Introduccion

2.1 Criterios convencionales de identificación humana

La identificación de individuos

Una de las acepciones de la palabra "Identificar" es "reconocer si una persona es la que se busca". Es decir, se trata de establecer su individualidad determinando aquellos rasgos o conjunto de cualidades que la distinguen de todos los demás y hacen que sea ella misma.

Las cuestiones relacionadas con la identificación de las personas tienen una enorme importancia en Medicina Legal, tanto en el caso de sujetos vivos como de cadáveres.

Conceptos aplicados a personas vivas.

En la identificación de delincuentes, enfermos mentales con amnesia, menores sin documentos, etc., resultan de utilidad las siguientes observaciones, siempre y cuando se cuente con archivos o datos suministrados por otras personas:

Exámenes generales

 Datos fisonómicos: la descripción de los rasgos fisonómicos constituye el medio más simple para la identificación, al que recurrimos en nuestra vida diaria: reconocemos visualmente a las personas cuyas facciones hemos registrado previamente en nuestra memoria.

Existe además una "memoria institucional", como la que poseen el Registro Civil y la Policía, que consiste en un archivo de fotografías de las personas en "documentos de identidad".

 Sexo: su determinación no ofrece dificultades, excepto en casos complejos de hermafroditismo.

 Peso, talla y edad estimadas.

 Sistema piloso: color, tipo y forma de implantación del cabello, o su ausencia.

 Color de ojos y piel.

 Marcas particulares: cicatrices, defectos congénitos, tatuajes y estigmas profesionales.

Huellas dactilares:

Son las impresiones que dejan los pulpejos de los dedos manchados con tinta, sudor u otros líquidos, sobre una superficie pulimentada, constituídos por surcos y crestas que dan lugar a figuras siempre diferentes, gracias a lo cual permiten la identificación de las personas.

Las huellas dactilares se prestan a una clasificación coherente y a su ordenación en archivos de sencilla localización (Galton, 1892; Henry, 1900; Jiménez Jerez, 1913). No se han hallado dos personas en las que sean idénticas, ni aún en los gemelos univitelinos.

Registro de la voz:

La frecuencia y amplitud de las vibraciones de las cuerdas vocales resultan propias e idénticas para cada persona, incluso si se intenta disimular la voz (Kersta, 1962).

Por otra parte, mediante la aplicación de métodos lingüísticos analíticos, es posible obtener indicios sobre la edad, sexo, nivel cultural, ocupación y antecedentes geográficos y étnicos del hablante ("Manual de Ciencias Forenses", FBI).

Trazado caligráfico:

La firma y el trazado caligráfico presentan características propias del ejecutor, que pueden conducir a su identificación comparándolos con los obrantes en archivos o escritos indubitados (Del Picchia, 1993).

Guzmán (1994) afirma que "del mismo modo que no hay dos seres humanos idénticos, tampoco hay dos escrituras idénticas: las peculiaridades físicas y mentales de cada individuo originan personalidades gráficas indiscutiblemente únicas y diferentes unas de otras".

En tal sentido, debe tenerse en cuenta que para la confección de un escrito existen, además de impulsos cerebrales inconscientes, mecanismos motrices muy automatizados que, si bien soportan cambios graduales en el curso de la vida, no hacen perder los elementos básicos de la escritura.

Huellas genéticas:

Desde mediados de la década pasada, el estudio de regiones hipervariables presentes en el genoma humano resulta de gran utilidad en la identificación de individuos, a partir de un registro previo o bien de sus familiares biológicos.

Dado que estas secuencias son heredables, permiten además efectuar estudios de paternidad, a diferencia de los sistemas identificatorios previamente mencionados.

Cuando se trata de cadáveres recientes, se aplican las mismas observaciones que para individuos vivos, con la obvia exclusión del registro de voz y trazado caligráfico. Con el transcurso del tiempo, se producen una serie de modificaciones que dificultan la identificación.

Las modificaciones post-mortem

Desde el mismo momento de la muerte, comienzan a producirse cambios físicos y químicos, que deben tenerse en cuenta a los efectos de la identificación individual.

Gisbert Calabuig (1991) los clasifica de acuerdo con el efecto más o menos deletéreo sobre el tejido cadavérico en procesos "destructores" o "conservadores".

Procesos destructores del cadáver

 Autólisis:

Es el conjunto de procesos fermentativos anaeróbicos que ocurren en el interior de la célula por la acción de las propias enzimas celulares, sin intervención bacteriana (Laiho and Pentilla, 1981). La necrosis se produce por la liberación al citoplasma de las enzimas contenidas en los lisosomas.

Es el más precoz de los procesos transformativos cadavéricos, siendo sucedido por la putrefacción. A menudo, los fenómenos autolíticos y putrefactivos se superponen en su evolución.

 Putrefacción:

Consiste en un proceso de fermentación pútrida de origen bacteriano (Evans, 1963). Los gérmenes producen enzimas que actúan selectivamente sobre proteínas, grasas e hidratos de carbono, dando lugar a modificaciones profundas del cadáver que conducen a su destrucción.

Una vez terminado este proceso, sólo persisten las partes esqueléticas de naturaleza calcárea, los dientes, las uñas y los pelos, mientras que las partes blandas se reintegran al ciclo biosférico.

La putrefacción evoluciona en cuatro fases o períodos:

I- Período colorativo o cromático: se produce una mancha verde en la fosa ilíaca derecha, que después se extiende a todo el cuerpo. Se va oscureciendo progresivamente hasta asumir un tono pardo negruzco, a veces con un matiz rojizo por la hemólisis concomitante.

Este período se inicia 24 horas después de la muerte y dura varios días.

II- Período enfisematoso o de desarrollo gaseoso: Se producen gases que desfiguran todas las partes del cadáver: se hinchan visiblemente el tórax, el abdomen y la cabeza, los ojos presentan exorbitismo y la lengua se proyecta al exterior de la boca.

Se origina una circulación sanguínea post-mortem por la contracción del ventrículo izquierdo y por la presión de los gases putrefactivos, permitiendo la observación de la red vascular superficial.

Este período dura entre varios días y un par de semanas.

III- Fase colicuativa: La epidermis se despega de la dermis, formándose ampollas llenas de líquido. Los gases se van escapando y el cuerpo pierde el aspecto "hinchado" característico de la fase anterior.

Este período dura de 8 a 10 meses.

IV- Reducción esquelética: Paulatinamente, a lo largo de 2 a 5 años, todas las partes blandas del cadáver irán desapareciendo. Los elementos más resistentes suelen ser el fibroso, ligamentos y cartílagos, por lo cual el esqueleto permanece unido durante todo este período, aunque al final también llegan a destruírse estos elementos.

Procesos conservadores del cadáver

a- NATURALES

b- ARTIFICIALES

Momificación

Conservación transitoria

Saponificación

Embalsamamiento

Corificación

Refrigeración

Congelación

 

a - NATURALES

 Momificación: Consiste en la desecación del cadáver por evaporación del agua de sus tejidos, manteniendo sus formas exteriores de un modo notablemente prolongado. El hecho esencial de este proceso radica en la rápida desecación del cuerpo, que al privarle de agua hace imposible el desarrollo de los gérmenes, por lo cual detiene e impide la putrefacción ordinaria (Franchini, 1939).

Las circunstancias ambientales favorecedoras de la momificación son: sequedad, calor y aire circulante con facilidad y abundancia. Entre las condiciones individuales merecen citarse la delgadez y la corta edad, por ser en ellos más sencillos los procesos de deshidratación cadavérica.

 Saponificación: es un proceso transformativo que conduce a la formación de una coraza grasa, untuosa y viscosa en estado húmedo, pero que después de haberse secado al aire adquiere consistencia dura, granulosa, de color gris blanquecino (Hausman et al, 1970). Debido a que la sustancia poseía propiedades intermedias entre la grasa y la cera, originalmente se le dió el nombre de adipocira.

Desde el punto de vista ambiental, favorecen la saponificación la humedad y el obstáculo al acceso de aire, mientras que desde el punto de vista individual lo primordial es la existencia más o menos abundante de grasa en el cadáver.

 Corificación: consiste en un embalsamamiento natural, que sólo tiene lugar en cadáveres conservados en ambientes herméticos. La piel adquiere el aspecto y la consistencia del cuero recién curtido, por una marcada desecación de todos los tejidos, con mantenimiento notable de las formas.

 Congelación: el frío intenso y prolongado permite la conservación del cadáver en forma prácticamente indefinida. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que una vez producida la descongelación se aceleran los procesos destructores del cadáver.

b - ARTIFICIALES

 Conservación transitoria: Se logra mediante inyección o sumersión en formol y/o con sustancias antisépticas como el sulfato de cinc.

 Embalsamamiento: Consiste en una inyección intraarterial generalizada de un líquido fijador y conservador a base de formol, el cual realiza simultáneamente el drenaje de la sangre venosa, complementada con el tratamiento de las grandes cavidades por la introducción del mismo u otro líquido conservador. Se completa con un conjunto de maniobras estéticas sobre las partes que permanecerán visibles dentro del féretro (Lecha-Marzo, 1924).

 Refrigeración: Se realiza en cámaras especiales, que mantienen la temperatura alrededor de 4 grados centígrados, con el objeto de retardar los procesos destructores del cadáver con fines forenses o de estudio.

¿Cómo se identifica un cadáver?

Ante el hallazgo de restos cadavéricos o huesos aislados, se plantean en la práctica forense varios interrogantes, que se tratan de resolver en forma sucesiva: datación de los restos, diagnóstico de especie y diagnóstico individual.

Datación de los restos:

Se trata de establecer cuándo ocurrió la muerte del sujeto, en base a diferentes criterios (Castellano et al, 1984):

 Morfológicos: se estudian las modificaciones post-mortem, que varían en función del tiempo de muerte, de acuerdo a lo reseñado en el capítulo anterior.

 Químicos: los huesos antiguos sufren cambios químicos, con degradación putrefactiva gradual de la parte orgánica y enriquecimiento en minerales, que a su vez se intercambian con los del suelo en que se encuentran en contacto.

 Biológicos: se estudia la fauna cadavérica, que varía notablemente con el tiempo.

Diagnóstico de especie:

No ofrece dificultad cuando el esqueleto está completo, dadas las notables diferencias anatómicas entre las distintas especies animales (Aznar y Maestre, 1945). Caso contrario, se recomiendan métodos inmunológicos, basados en reacciones antígeno-anticuerpo (Schleyer, 1962), ó análisis de ADN, ya que casi todas las regiones variables estudiadas en la práctica forense son específicas de material biológico humano.

Diagnóstico individual:

Datos genéricos

Permiten situar los restos dentro de un grupo más o menos amplio de individuos, estableciendo características étnicas, sexo, edad y talla aproximada (Azevedo Neves, 1949; Eliakis et Iordanidis, 1963a,b, 1966).

 Características étnicas: consiste en el estudio antropológico del cráneo, de los índices cefálicos, facial superior, nasal y prognatismo.

 Sexo: es posible morfológicamente cuando se dispone de pelvis, cráneo y/o fémures. Caso contrario, debe analizarse el ADN estudiando secuencias características de los cromosomas X e Y.

 Edad: el sistema óseo experimenta transformaciones muy marcadas en los períodos extremos de la vida, infancia y senectud, pero paulatinos y poco evidentes en las edades intermedias, lo cual limita la exactitud de esta determinación.

 Talla: existe una correlación muy definida entre la talla y la longitud de los huesos largos, que permite un cálculo bastante aproximado. Cuando sólo se cuenta con otros huesos, se emplean tablas de conversión basadas en la proporcionalidad existente entre los distintos segmentos del cuerpo.

Datos individualizadores:

 Elementos extrínsecos al cadáver: se analizan aquellos objetos que resisten el paso del tiempo sin destruírse, como cinturones, medallas, anillos o relojes.

 Caracteres patológicos, naturales o traumáticos que afecten el esqueleto.

 Identidad radiográfica: varios autores han propuesto la medición de parámetros radiográficos con fines de identificación individual (Asherson, 1965; Calicó, 1933; Clavelin et Dérobert, 1946), actualmente casi en desuso.

Mayor interés tiene el método desarrollado por Glaister (1945), que consiste en superponer una radiografía del cráneo y cara con una fotografía de la supuesta víctima, ambas a la misma ampliación. Gill et al (1993) realizaron con éxito la superposición en la identificación de miembros de la familia real rusa, asesinados en 1917.

 Identificación dental: los dientes son las piezas más resistentes del cuerpo a la destrucción tanto física como química. Un estudio detallado permite conocer especie, raza, sexo, talla y edad aproximadas, además de valiosos datos sobre identificación individual (Clement and Sri-Skanda, 1985; Seigal et al, 1975). En este último caso, es imprescindible contar con información dental previa de la supuesta víctima .

Las fuentes de variabilidad en los dientes pueden ser de naturaleza congénita, como la forma y el tamaño; estigmas debidos a profesiones o hábitos, como el color característico en los fumadores; enfermedades graves de la infancia que afectan la formación de la dentina y el esmalte; y la existencia de tratamientos odontológicos.

 Métodos bioquímicos: los análisis que evalúan el fenotipo, como los grupos sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, proteínas plasmáticas y enzimas eritrocitarias no suelen ser útiles en la identificación de cadáveres, ya que se alteran rápidamente luego de la muerte.

A partir de mediados de los '80, la detección y el aislamiento de secuencias hipervariables presentes en el genoma humano revolucionaron los criterios de identificación de individuos. La posibilidad de identificar a un sujeto empleando pequeñas muestras de fluídos corporales, como manchas de sangre o semen; o de tejidos, como pequeños fragmentos de piel o bulbos pilosos, ha ampliado, en gran medida, el espectro metodológico de la Bioquímica Forense.

Las variabilidad de estas zonas del genoma radica en diferencias exhibidas por el material genético: el ácido desoxirribonucleico (ADN), que pueden reflejarse sea en la secuencia nucleotídica misma a través de sustituciones de nucleótidos, o en la distinta longitud generada por una misma secuencia que se repite un número diferente de veces, como fuera demostrado por primera vez por Wyman and White (1980). Comenzaron a ser estudiadas cuando fué posible conocer su localización y/o desarrollar una metodología adecuada para ponerlas de manifiesto, mediante sistemas de análisis cada vez más precisos y sencillos.

Los primeros trabajos, publicados a mediados de los '80, empleaban fragmentos de ADN obtenidos por digestión con enzimas, separados electroforéticamente y transferidos a un soporte sólido, el cual se trataba con una "sonda" constituída por secuencias complementarias de las regiones variables, marcada radiactivamente. Por autorradiografía, resultaba posible observar varias bandas, de localización desconocida dentro del genoma, pero que eran características de cada individuo y se heredaban de padres a hijos (Jeffreys, 1985).

Si bien las bandas producidas por estas sondas multilocus eran muy variables de una persona a otra, los resultados eran difícilmente reproducibles, ya que pequeñas y poco controlables diferencias en la corrida electroforética (voltaje, tiempo, concentración del gel) afectaban en gran medida la la reproducibilidad e interpretación de los resultados.

El descubrimiento de regiones hipervariables del genoma con localización específica permitieron el desarrollo de las sondas de locus único (Nakamura et al.1987) resolvería el problema, permitiendo el estudio de una zona conocida del genoma, que se visualizaba como dos únicas bandas para la condición heterocigota, correspondientes cada una a un alelo.

Estas zonas están constituídas por secuencias repetidas, que aparentemente carecen de función como codificantes de polipéptidos. La menor variabilidad exhibida por estos sistemas de análisis se solucionaba empleando un conjunto de cuatro o más sondas unilocus.

Sin embargo, aún persistía un inconveniente para el empleo masivo de estas metodologías en la práctica forense: las sondas multilocus, y en menor medida las unilocus, requerían un ADN en estado óptimo en cuanto a su integridad, de alto peso molecular, lo cual rara vez ocurre en cadáveres en proceso de descomposición, o en manchas antiguas de fluídos biológicos o expuestas a condiciones ambientales adversas.

La solución llegó con el desarrollo de técnicas de amplificación de porciones de ADN mediante la "reacción en cadena de la polimerasa" o PCR, con las cuales fué posible implementar sistemas de análisis de secuencias más pequeñas ("microsatélites"), pero menos variables que las anteriores. Con el advenimiento de esta nueva técnica, se hizo posible la evaluación de polimorfismos en cuanto a la secuencia nucleotídica de la región variable, además de las diferencias de longitud.

Actualmente, la posibilidad de analizar un gran número de ellas permite realizar estudios certeros a partir de material biológico degradado en forma severa.

2.2 La identificacion de individuos por tecnicas bioquimicas que evaluan el fenotipo.

Las técnicas bioquímicas de identificación de individuos, previas al conocimiento actual del ADN, se basaban en la comparación de productos de expresión de diferentes genes. Estas proteínas, como los antígenos eritrocitarios (grupos sanguíneos), enzimas eritrocitarias, proteínas plasmáticas y antígenos de histocompatibilidad (HLA), son marcadores que se transmiten obedeciendo a las leyes mendelianas de la herencia:

Grupos sanguíneos:

Sus antígenos se hallan en la superficie de los glóbulos rojos, y sus correspondientes anticuerpos forman parte de las inmunoglobulinas del plasma.

Los antígenos del sistema ABO se hallan también en otras células y en fluídos corporales (saliva, orina, semen, leche) en individuos secretores. Al sistema ABO, descubierto en 1901 por Landsteiner, se fueron agregando posteriormente otros, como el RH, MNS, Duffy, Lewis, Kidd, Lutheran, etc. En conjunto, presentan un rango de probabilidad de exclusión (es decir, de excluir la paternidad biológica de padres falsamente alegados), de alrededor del 75 %.

Proteínas plasmáticas:

Las más frecuentemente utilizadas como marcadores genéticos en las pruebas de filiación son la haptoglobina, alfa-1- antitripsina, transferrina, proteínas grupo específicas Gc, orosomucoide, factor B del sistema properdina, fracción C3 del complemento, alotipos Gm y Km, de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulinas. Su rango de probabilidad de exclusión es de alrededor de 71 %.

Enzimas eritrocitarias:

Las que presentan mayor polimorfismo son la fosfatasa ácida eritrocitaria (EAP), adenilato kinasa (AK), transaminasa glutámico-pirúvica (GPT), fosfoglucomutasa (PGM), esterasa D (EsD), adenosín deaminasa (ADA), fosfogluconato dehidrogenasa (PGD) y glioxalasa (GLO). El rango de probabilidad de exclusión oscila en el 61 %.

Antígenos de histocompatibilidad (HLA):

Están codificados por los genes del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, ubicados en los loci A, B, C, D, DR, DQ y DP del brazo corto del cromosoma 6.

Los antígenos HLA-A, B y C están presentes en todas las células nucleadas del organismo; en cambio los HLA-D y R se distribuyen en forma más limitada: sobre linfocitos B, macrófagos, espermatozoides, células de Langerhans, etc.. Presentan en su conjunto un rango de probabilidad de exclusión de aproximadamente 95 %.

Las pruebas de HLA en estudios de paternidad comenzaron a ser aceptadas en las Cortes a partir de principios de los '70, aunque su origen científico se sitúa unos 15 años antes por su utilidad en otra área de la identificación humana: la determinación de la compatibilidad entre dador y receptor de un transplante de órganos.

 

2.3 La identificacion de individuos por tecnicas bioquimicas que evaluan el genotipo: los analisis de adn.

Estructura y funcion del ADN

En los organismos vivos, la información hereditaria es almacenada en el ácido desoxirribonucleico (ADN), constituyendo éste el material genético primordial, a excepción de algunos virus que almacenan su información genética en el ácido ribonucleico (ARN).

El ADN fué descubierto por Miescher en 1871, pero recién se lo identificó como portador de la información genética a mediados de nuestro siglo (Avery et al, 1944; Hershey and Chase, 1952). En 1953, Watson and Crick (1953a, b) sugieren un modelo tridimensional para su estructura y mecanismo de replicación, confirmados posteriormente.

De acuerdo con el modelo propuesto, el ADN es una molécula bicatenaria, constituída cada cadena por la secuencia de unidades químicas denominadas nucleótidos. Cada nucleótido está compuesto por una pentosa, la deoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada.

Los nucleótidos difieren solamente a nivel de las bases nitrogenadas, que son de dos tipos: las purinas, representadas por la guanina (G) y la adenina (A); y las pirimidinas, constituídas por la citosina (C) y la timina (T).

A lo largo de la cadena polinucleotídica, los nucleótidos se unen por uniones fosfodiéster, resultando una secuencia alternante azúcar-fosfato y emergiendo las bases nitrogenadas en forma perpendicular a esta estructura.

Las dos cadenas polinucleotídicas dextrohelicoidales, enrolladas sobre un mismo eje, constituyen una doble hélice. Cada una de ellas presenta una orientación de sus puentes fosfodiéster 3'-5' internucleotídicos opuesta a la de la otra, determinándose así el antiparalelismo de las cadenas.

Las bases nitrogenadas de una de las cadenas se aparean, sobre el mismo plano, con las emergentes de la otra cadena. Debido a problemas estéricos, sólo son posibles dos tipos de apareamiento: A-T y G-C, que son precisamente los que presentan una exacta equimolaridad en todos los ADNs estudiados (Chargaff, 1950). El par A-T está mantenido por dos puentes de hidrógeno, en tanto que el par G-C lo está por tres.

Las bases nitrogenadas son hidrofóbicas, ubicándose en el interior de la doble hélice, en tanto que los azúcares y fosfatos, por estar cargados eléctricamente, están expuestos al contacto con el agua. De esta manera, la estructura del ADN no sólo está mantenida por las uniones puente de hidrógeno, sino también por las interacciones hidrofóbicas generadas cooperativamente al apilarse las bases.

Las dos cadenas de la doble hélice no son idénticas, ni en composición ni en secuencia de nucleótidos, pero sí mutuamente complementarias: enfrentada a una T siempre habrá una A en la otra cadena, así como enfrentada a una C de una cadena siempre habra una G en la otra y viceversa. Esta complementariedad sólo puede darse en forma antiparalela, presentando una de las cadenas el sentido 5'-3' (determinado por las uniones fosfodiéster internucleotídicas), y la otra el sentido 3'-5'.

El modelo postulado por Watson y Crick sobre la estructura del ADN les permitió proponer, a la vez, un mecanismo de replicación: ya que las dos cadenas son complementarias, durante la replicación podría producirse la separación de las cadenas de la molécula, constituyendo cada una un molde sobre el que se sintetizaría la cadena hija, complementaria.

Como resultado, se obtendrían dos moléculas hijas, constituída cada una de ellas por una cadena parental y una sintetizada usando aquella como molde. Se plantearon así las bases de la replicación semiconservativa del ADN, posteriormente comprobada en forma experimental (Meselson and Stahl, 1958).

El ADN en la identificación individual: una revolución en la Bioquímica Forense.

A partir del descubrimiento de polimorfismos hipervariables en el ADN por Wyman and White (1980), y de la posibilidad de emplearlos en identificación humana, lograda por Jeffreys (1985), los rangos de probabilidad de exclusión se incrementaron enormemente, a más del 99,99 %, superando incluso a la aplicación de todos los sistemas anteriores en conjunto.

Reseña histórica

En orden cronológico, puede decirse que el puntapié inicial de los análisis de ADN se produce en abril de 1985, cuando el primer caso judicial es resuelto por aplicación de técnicas moleculares de caracterización de secuencias hipervariables en el ácido desoxirribonucleico (ADN) (Jeffreys et al., 1985a).

Los resultados obtenidos mediante el estudio de las Huellas Digitales Genéticas (HDG) o "DNA-Fingerprinting" permitieron aclarar una disputa por inmigración a Gran Bretaña (Jeffreys et al 1985b). Poco tiempo después, una corte civil inglesa acepta la evidencia de ADN en un caso de paternidad discutida.

El debut de esta prueba en la investigación criminal se produce en octubre de 1986, en un caso de homicidio en el que se comprobó la inocencia del principal sospechoso (Gill and Werret, 1987; Wong et al.,1987).

Recién a partir del año 1987, las pruebas de ADN son admitidas como evidencia en las Cortes Criminales de Gran Bretaña y de Estados Unidos.

En 1988 se desarrollan técnicas de amplificación de ADN de pequeñas regiones variables del genoma, partiendo de sólo 1700 células diploides, equivalentes a unos 10 nanogramos de ADN (Saiki et al, 1988).

Estas técnicas, denominadas genéricamente reacción en cadena de la polimerasa ("Polymerase Chain Reaction" o PCR), emplean iniciadores o primers, que son secuencias de ADN complementarias de las zonas flanqueantes de la zona de interés (Jeffreys et al, 1989), que es amplificado por una ADN polimerasa durante ciclos térmicos adecuados, lográndose millones de copias de la región.

En 1989, y a causa de estudios de dudosa verosimilitud efectuados por la empresa americana Lifecodes Corp. en un caso criminal, se discute en los Estados Unidos la validez científica de estas pruebas para uso forense (Lander, 1989), resultando en una revisión crítica de las técnicas utilizadas por los distintos grupos de investigadores.

En 1990, el U.S. Congress Office of Technology Assessment concluye que la identificación de individuos basada en las pruebas de ADN es científicamente válida, siempre que se disponga de la certeza metodológica de su realización. La estandarización de las mismas ha sido encarada, entre otros, por los laboratorios del FBI (FBI Academy, Quantico, 1989).

La razón fundamental de la amplia difusión de estas técnicas estriba en el hecho de que, mientras la serología clásica y los marcadores genéticos evaluables fenotípicamente presentan un número muy limitado de genotipos posibles, el continuo descubrimiento de nuevas regiones hipervariables en el ADN resuelve el problema de la identificación certera de individuos y del establecimiento de vínculos biológicos de parentesco (Chakraborty and Jin, 1993).

En los primeros trabajos con utilización de las técnicas de PCR, si bien resultaba posible evaluar regiones de una muestra de ADN que podía estar muy degradada, la escasa variabilidad entre los individuos componentes de la población general conspiraba contra la certeza incriminatoria del análisis: era factible que una evidencia coincidiera con un sospechoso por azar, y mucho más aún, que a un padre alegado le fuera atribuída erróneamente la paternidad biológica de un descendiente putativo.

A partir de los ´90, la posibilidad de evaluar un gran número de sitios variables localizados en diferentes zonas del genoma (Edwards et al, 1991), permitió analizar, aunque fuera parcialmente, muestras de tejido humano quemado y en estado de putrefacción, como el derivado del atentado a la Embajada de Israel (Corach et al, 1992).

Posteriormente, la incorporación de un número aún mayor de sistemas hizo posible el establecimiento de vínculos biológicos de parentesco a través de secuencias de ADN de muy pequeño tamaño, con lo cual se logró la identificación de cadáveres momificados, con reducción ósea total o quemados (Penacino and Corach, 1993; Penacino et al, 1994c).

Las multiples alternativas de analisis

A la luz del conocimiento actual, los sistemas de análisis de ADN pueden dividirse en dos grandes grupos: los basados en diferente longitud de la región variable, debidos a VNTR (Variable Number Tandem Repeats - repeticiones en tandem de número variable), y los basados en diferencias en la secuencia nucleotídica.

Los polimorfismos de longitud pueden ponerse de manifiesto mediante enzimas de restricción (RFLPs) o por amplificación de la región variable. En ambos casos, el resultado observable es similar: diferentes individuos presentan distinta longitud de los fragmentos de ADN obtenidos luego del corte con la enzima de restricción seleccionada o de la amplificación de la región de interés.

Sistemas basados en diferente longitud de la región variable:

Evaluación de minisatélites:

Los minisatélites son regiones del genoma no codificantes, con más de 600 pares de bases de tamaño. En los que involucran unidades repetidas, cada una presenta, por lo general, entre 12 y pocos cientos de pares de bases. Pueden evaluarse mediante:

Transferencia del ADN a soportes sólidos (técnica de Southern):

Se emplea una sonda o probe complementaria de la región hipervariable. Las sondas se clasifican, de acuerdo con la localización y número de sitios que presentan sus secuencias complementarias en el genoma, como:

 De locus múltiple: Estas sondas reconocen ("hibridizan") a diferentes regiones del genoma, ubicadas en distintos cromosomas, cuya localización precisa se desconoce, produciendo DNA-fingerprints ("huellas digitales genéticas") individuo-específicos sobre una membrana que contiene ADN fragmentado enzimáticamente y separado por electroforesis. Las bandas obtenidas se heredan mendelianamente, por lo cual provienen en forma aproximada en un 50 % de cada uno de los progenitores.

Entre ellas, las denominadas 33.6 y 33.15, desarrolladas por Jeffreys (1985a) que detectan unos 17 fragmentos variables de DNA por individuo, de entre 3.5 y 20 kilobases, o bien el fago M13, que posee secuencias capaces de generar huellas digitales genéticas (HDG), individuo-específicas (Vassart et at, 1987).

Otro ejemplo de este tipo de sondas lo constituyen los oligonucleótidos, en secuencias repetidas 5 veces CAC/GTG que también son generadores de fingerprints (Nurnberg et al., 1989).

Si bien son sumamente informativas para caracterizar a un individuo, presentan dos inconvenientes que las hacen inapropiadas para los estudios forenses: por un lado, requieren un ADN en buen estado de conservación, de alto peso molecular, que no suele obtenerse a partir de muestras de interés forense; y por otro, dependen de variables experimentales de difícil estandarización, lo que hace casi imposible reproducir los resultados.

 De locus único o locus específicas: detectan un solo locus hipervariable con una banda por alelo; dada la naturaleza diploide de los humanos, se obtienen patrones de dos bandas (heterocigotas), o patrones de una banda (homocigotas, con alelos de similar tamaño).

Su variabilidad está dada por secuencias que se repiten un cierto número de veces, generándose fragmentos de restricción de diferente tamaño (VNTRs), más grandes cuanto más veces esté repetida dicha secuencia. Son altamente polimórficas, por ejemplo, para la sonda YNH24 se han detectado alrededor de 70 alelos de distinto tamaño en la población mundial.

Cabría esperar que esta multiplicidad produjera una muy alta capacidad resolutiva, sin embargo, algunos alelos se encuentran mucho más representados que otros en la población, por lo cual la mayor o menor certeza de los estudios efectuados dependerá de los análisis de las frecuencias poblacionales para cada variante alélica o banda, que presente cada sistema en particular. Estos estudios deben realizarse previamente sobre muestras tomadas al azar de individuos no relacionados, de aquella población de la cual emergen las muestras a ser analizadas.

La certeza del análisis puede incrementarse utilizando un conjunto de varios loci hipervariables (Wong et at, 1987; Smith et al, 1990), lo cual disminuye prácticamente a cero la probabilidad de error.

La Figura 1 resume esquemáticamente los pasos a seguir para el análisis de una muestra con una sonda de locus específico.

Figura 1

 

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR o Polymerase Chain Reaction):

La amplificación mediante PCR requiere pequeñas secuencias de ADN sintético los que actuan como iniciadores o primers, que son complementarios de las regiones flanqueantes de la zona de interés. Se produce mediante varios ciclos (generalmente de 25 a 35), cada uno de los cuales consta usualmente de tres pasos, efectuados mediante cambios de temperatura:

I- Desnaturalización: ruptura de los puentes de hidrógeno, quedando el ADN como simple cadena.

II- Reasociación o annealing: los primers se reasocian a las zonas complementarias.

III- Extensión: se sintetiza ADN, con los nucleótidos y una ADN polimerasa que se hallan en la mezcla de reacción, generándose al final del proceso millones de copias de la región de interés.

Esquemáticamente, la reacción de amplificación se representa en la Figura 2.

Figura 2

El uso de la enzima termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus, denominada Taq polimerasa para la "extensión" (Saiki et al, 1988), permitió la automatización del proceso mediante el empleo de cicladores térmicos electrónicos. El análisis genético podría efectuarse, entonces, en forma eficiente y fidedigna aún a partir de una simple célula (Jeffreys et al.1988, 1990).

Si bien se detectaron varios sistemas de minisatélites analizables por amplificación por PCR y análisis del tamaño de los productos (Amp-FLP o Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados) como el Apo B (Boerwinkle et al, 1989), el YNZ-22 (Wolff et al, 1988), y el COL2A1 (Wu et al, 1990), tal vez el sistema más difundido lo constituye la región altamente polimórfica, de gran tamaño, constituída por 16 pares de bases repetidas de 18 a 42 veces, que se halla ubicada en el locus D1S80 y presenta 22 alelos detectados en la población general (Budowle et al, 1991; Sajantila et al, 1991; Baechtel et al, 1993; Kloosterman et al, 1993).

Evaluación de microsatélites:

Cada unidad de repetición de los microsatélites posee entre 2 y 5 nucleótidos, por lo cual se requiere la amplificación por PCR y evaluación posterior mediante geles de poliacrilamida (PAGE), similares a los empleados en secuenciación de ADN, que permiten discriminar diferencias de longitud de sólo un nucleótido.

Estas pequeñas secuencias presentan un número variable de repeticiones en tándem (STRs o "short tandem repeats"), desarrollándose los "primers" necesarios para su amplificación. Edwards et al (1991) describen 10 sistemas distintos, localizados en los cromosomas 1, 4, 6, 7, 11, 12 y X, que involucran secuencias repetidas de 3 ó 4 bases. Desde entonces, se incorporaron un número creciente de microsatélites (Kimpton et al, 1992; Polymeropoulos et al, 1992; Wiegand et al, 1993; Hammond et al, 1994). (Figura 2 bis).

Figura 2 bis

Sistemas basados en diferencias en las secuencias nucleotídicas:

Variantes génicas nucleares

El primero y más difundido análisis con aplicación forense, es el que estudia una región localizada en el segundo exón del gen HLA-DQ-a del complejo mayor de histocompatibilidad (HMC). La corporación Cetus (USA) desarrolló un sistema que permite detectar, de esta región polimórfica, seis alelos diferentes, denominados 1.1, 1.2, 1.3, 2, 3 y 4, por lo cual existen 21 genotipos distintos en la población general (Higuchi et al, 1988; Saiki et al, 1989; Amplitype User Guide, 1990; Comey et al, 1993).

Posteriormente, Cetus Corp. implementó un sistema denominado "Polymarker", que incluye, además del mencionado HLA-DQ-a otros cinco loci variables: LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, y Gc. Cada uno de ellos presenta dos o tres alelos diferentes en la población general (Budowle, 1994).

Variantes de ADN mitocondrial

Dentro de los sistemas cuya variación reside en la secuencia de nucleótidos, merece especial atención el estudio del ADN presente en las mitocondrias. En el año 1981, Anderson y col. publican la secuencia completa del genoma mitocondrial (Anderson et al., 1981), de aproximadamente 16,5 Kb, que presenta una región no codificante, denominada D loop, donde se encuentra el origen de replicación, y que se caracteriza por presentar sitios con elevado índice de mutación.

Debido a que la información contenida en la secuencia mitocondrial es heredada a partir de la vía materna exclusivamente esto permite establecer vínculo de parentesco entre individuos maternalmente relacionados (Giles et al, 1980) El análisis de la secuencia permite diferenciar un individuo de otro de distinto linaje materno (Higuchi et al, 1988).

Esta característica, sumada a que cada célula contiene una gran cantidad de mitocondrias y por ello el genoma mitocondrial se halla mucho más representado que el contenido en el núcleo celular, hace que este sistema sea de suma utilidad, principalmente en los casos de material ampliamente degradado.

A partir del análisis de esta secuencia han sido caracterizados restos arqueológicos de varios miles de años de antigüedad, en los que fue factible obtener ADN mitocondrial relativamente bien conservado (Paabo, 1990).

Evolución metodológica y perspectivas

A partir de 1990, los análisis mediante PCR fueron ganando espacio en los laboratorios forenses, debido a la relativa simplicidad de sus técnicas, menor costo e interpretación sencilla de los resultados, pero por sobre todo por requerir ínfimas cantidades de ADN: actualmente, es posible partir de tan sólo un nanogramo para analizar cada uno de los sistemas variables.

En algunas muestras tales como pequeñas manchas de sangre o semen, saliva, pelos o cadáveres antiguos, constituye la única posibilidad de lograr una caracterización genética (Hagelberg et al, 1991; Jung et al, 1991; Comey et al, 1991, 1993; Blake et al, 1992; Uchihi et al, 1992; Walsh et al, 1992).

En nuestro país, el Servicio de Huellas Digitales Genéticas se hace cargo hacia fines de 1991, de los análisis judiciales que involucran estudios de ADN, fijando criterios de estandarización internacionalmente aceptados y estrategias de recolección y análisis de muestras forenses (Corach et al, 1993a; Penacino y Corach, 1993b).

Las muestras de interés forense a ser amplificadas mediante PCR requirieron tratamientos especiales en cuanto a la extracción y purificación del ADN, que fue encarado por varios equipos de investigación, lográndose métodos eficientes a partir de ínfimas cantidades de material (unos 3 microlitros de sangre) (Chelex protocols, 1990; Corach, 1991; Jung et al, 1991).

El desarrollo reciente de un método alternativo que utiliza bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) permite extraer ADN de huesos, dientes, piel y músculos humanos, con una notable reducción de contaminantes que dificultarían el análisis posterior (Corach et al, 1994a). Esta situación representa una gran ventaja respecto a los métodos tradicionales que emplean combinaciones de enzimas proteolíticas (proteinasa K, pronasa, etc.), y agentes caotrópicos (lauril sulfato de sodio, etc.).

Así, sintetizando la breve historia de la metodología empleada por la Biología Molecular Forense desde sus inicios, podemos observar cómo los análisis mediante sondas multilocus fueron reemplazados por las sondas de locus único, en caso de poder obtenerse ADN suficiente (alrededor de 200 nanogramos); y por sistemas de análisis basados en PCR si el ADN se encuentra en menor cantidad, ambos sistemas altamente reproducibles y de fácil interpretación (Hochmeister et al, 1991; Mangin et al, 1991; Mulhare et al, 1991).

Otra modificación de las técnicas tradicionales consiste en el paulatino abandono de los métodos que emplean isótopos radiactivos, que son reemplazados con eficiencia similar por sistemas quimioluminiscentes (Sheffield et al, 1992; FBI, 1993).

El desarrollo, validación y aplicación de nuevos sistemas a nivel mundial se ve reflejado en su incorporación en nuestro medio, en el Laboratorio del Servicio de Huellas Digitales Genéticas.

Controles de calidad

Ante el empleo de primers y sondas semejantes en todo el mundo, validadas para uso forense, se han encarado actualmente sistemas de control de calidad en Europa (a través de la EDNAP -European DNA Profiling-) y EEUU (mediante el TWGDAM -Technical Working Group on DNA Analysis Methods-) con el objeto de unificar criterios y evitar errores de interpretación (Schneider et al, 1991; Hicks et al, 1991).

En nuestro medio, el Servicio de Huellas Digitales Genéticas se somete periódicamente a estos controles de calidad. Efectivamente, dada la ausencia de laboratorios policiales o judiciales argentinos, destinados al estudio del ADN en casos criminales y civiles, surgió como una necesidad el desarrollo, puesta a punto y empleo en la resolución de casos judiciales de las técnicas que siguen las tendencias mundiales, de probada eficacia y confiabilidad, como así también de efectuar estudios de frecuencias poblacionales de grupos étnicos autóctonos (Ginther et al, 1993; Sala y col, 1993, 1994a).

 2.4 Objetivos.

Los objetivos del presente estudio fueron los siguientes:

1.4.1- Desarrollar y perfeccionar técnicas de extracción y purificación de ADN a partir de fluídos biológicos (sangre y semen) y sus manchas.

1.4.2- Desarrollar y perfeccionar técnicas de extracción y purificación de ADN a partir de tejidos celulares obtenidos de cadáveres en diferente estado de conservación.

1.4.3- Desarrollar nuevos sistemas de caracterización molecular que resulten eficientes para el análisis de ADN altamente degradado, obtenido a partir de manchas de fluídos biológicos y/o restos humanos.

1.4.4- Establecer estrategias de recolección, manipulación y análisis de restos humanos emergentes de catástrofes en masa.

1.4.5- Sistematizar los conocimientos adquiridos referentes a la correlación entre las características tanatológicas del material de análisis y la investigación molecular basada en estudios de ADN.

1 Resumen 2 Introducción 3 Materiales 4 Métodos 5 Resultados 6 Discusión 7 Conclusiones 8 Bibliografia

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Colección: Derecho, Economía y Sociedad

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Última modificación: 09 de Marzo de 2007

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