Catálogo de la Colección "Derecho, Economía y Sociedad" Sitio Oficial de la Facultad de Derecho de la Universidad de Buenos Aires

Regulación jurídica de las biotecnologías

Curso dictado por la Dra. Teodora Zamudio

Equipo de docencia e investigación UBA~Derecho

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 Glosario

Investigación e implementación de sistemas de identificación de individuos por tecnicas de biologia molecular (Cap 3 y 4)


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... con especial referencia a los estudios post-mortem.

Tesista  Gustavo Adolfo Penacino.

Director: Dr. Daniel Corach.

Tesis doctoral  aprobada con Sobresaliente 11 de diciembre de 1997 Area Biologia Molecular

Universidad de Buenos Aires, Argentina.

Contacto actual con el autor: Director Unidad de Análisis de ADN, Colegio Oficial de Farmacéuticos y Bioquímicos, Rocamora 4045, Buenos Aires, Argentina. Tel/fax: (54) (11) 4862-1142. E-mail: gpenacino@wwiecorp.com. Website: www.adn.ac www.secretpaternity.com

3 Materiales

3.1-Fluidos corporales:

3.2 Pelos

3.3 Uñas

3.4 Restos humanos

3.5 Reactivos

4 Métodos

4.1 Procedimientos de extraccion de adn:

4.2 Purificacion del adn aislado:

4.3 Cuantificacion del adn purificado:

4.4 Analisis de adn de alto peso molecular

4.5 Analisis de adn en condiciones variables de degradacion: los métodos de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).

4.6 Desarrollo de sistemas "multiplex" de aplicacion forense.

 

1 Resumen 2 Introducción 3 Materiales 4 Métodos 5 Resultados 6 Discusión 7 Conclusiones 8 Bibliografia

 

3 Materiales

3.1-Fluidos corporales:

Fluídos corporales obtenidos experimentalmente

En estado líquido (sin soporte):

Se emplearon muestras de sangre anticoagulada con EDTA al 5% y de semen sin tratamiento previo, obtenidas de donantes voluntarios.

Fluídos biológicos en soportes sólidos:

Manchas de Sangre.

Se emplearon, para la implementación de las técnicas de extracción y purificación de ADN, muestras de sangre de un mililitro cada una, voluntariamente cedidas por donantes.

Estas muestras fueron distribuídas sobre diferentes soportes: papel de diario, tela de algodón y vidrio. El material seco así depositado y expuesto a temperatura ambiente dentro del laboratorio, fue posteriormente empleado para extraer ADN. Con el objeto de evaluar la eficiencia de las técnicas de extracción usadas y comprobar la antigüedad máxima de las manchas a ser analizadas, las extracciones se llevaron a cabo sobre media mancha (equivalente a 0,5 mililitros de sangre), a intervalos regulares de tiempo (desde tiempo=0 hasta veinte meses).

Las muestras obtenidas se resumen en la tabla I.

TABLA I

TIEMPO (días)

SOPORTES

 

VIDRIO

PAPEL

TELA

0

muestra a1

muestra b1

muestra c1

4

muestra a2

muestra b2

muestra c2

30

muestra a3

muestra b3

muestra c3

70

muestra a4

muestra b4

muestra c4

100

muestra a5

muestra b5

muestra c5

300

muestra a6

muestra b6

muestra c6

600

muestra a7

muestra b7

muestra c7

Mezclas de Semen/sangre.

Para implementar y desarrollar sistemas eficientes de purificación de ADN a partir de mezclas de semen y sangre, semejante a las halladas en los hisopados obtenidos luego del ataque sexual, se depositaron sobre hebras de algodón muestras de sangre/semen en diferentes proporciones, entre 5 y 500 ul de cada fluído. La evaluación del sistema de extracción se realizó mediante la comparación de los patrones de hibridación obtenidos luego del sondeo con secuencias de locus específico. Las mezclas se prepararon de acuerdo a la tabla II.

TABLA II

MUESTRA Nro.

SANGRE (ul)

SEMEN (ul)

1

500

0

2

495

5

3

450

50

4

400

100

5

250

250

6

0

500

Muestras obtenidas de casos reales

Muestras forenses provenientes de violaciones

Se analizaron los materiales que se detallan en la TABLA III. En éstas se considera cada caso en particular, numerado en forma correlativa (Caso nro.), el material analizado, de acuerdo a las siguientes abreviaturas y correspondiente detalle: HV, hisopado vaginal; HR, hisopado rectal; SD, sangre de la damnificada; SS, sangre del sospechoso; PR, prenda.

Los números indican cantidades de hisopados, muestras de sangre o prendas.

TABLA III

CASO

MUESTRAS

CASO

MUESTRAS

1

1HV, 1SD, 3PR, uñas víct.

22

1HV, 1SD, 1PR

2

1HV

23

1SS, 4PR

3

1SS, 1PR

24

1HV

4

1HV, 1HR

25

1HV, 1SD, 1PR

5

1HV

26

2SD, 1SS, 4PR

6

1HV, 1SD, 1SS

27

1HV, 1SS, 6PR

7

7PR, músculo imput.

28

1SD, 1PR

8

1PR

29

1SD, 1SS, 1PR

9

1SD, 1SS, 3PR

30

1HV

10

1HV

31

2SS, 3PR

11

1PR

32

1SD, 1SS, 1PR

12

4PR

33

1HR, 1SD, 1SS, 1PR

13

3HV, 1SD, 1PR

34

2HV, 1SD, 2PR

14

1PR

35

1HV, 1HR, 1SD, 1PR

15

1SD, 3PR

36

3HV, 2SD, 4SS, 1PR

16

1HV, 1SD

37

1HV, 1SD

17

1HV

38

2HV

18

1SD, 3SS, 1PR

39

1HV, 1HR, 1SD

19

1SD, 1SS, 3PR

40

1HV, 1HR, 1SD, 4PR

20

1HV

41

2SS, 3PR

21

1SS, 2PR

 

 

Otras muestras forenses que involucran fluídos biológicos en soportes sólidos:

CASO NRO.

TIPO DE SOPORTE DE LA MANCHA

 

ABSORBENTE

PARCIALM. ABS.

NO ABSORBENTE

1

tela, apósito

-

-

2

-

-

pinza metálica

3

telas

-

portaobjetos

4

gasa, lona

papel

-

5

gasa (**)

-

-

6

telas

papeles, colillas, piso de cemento

cuchillo, prismáticos

7

tela

-

-

8

tela

-

-

9

-

piso cemento

automóvil (carrocería), colectivo (carrocería y ruedas), moto (cubiertas)

10

-

-

autostéreo

11

-

-

jeringa c/aguja, cuchillo

12

tela

-

-

13

papel filtro (*)

-

-

14

gasa (*)

-

-

15

-

maderas

-

16

tela (**)

-

-

17

tela

-

-

18

tela

-

preservativo

19

tela

cartón

suela zapatilla

20

-

-

cara imputado

21

tela

-

-

22

tela

-

-

23

papel filtro (*)

-

-

24

tela

-

-

25

tela (**)

-

palo escoba

26

-

papel cuaderno

-

27

-

papel diario

-

28

tela

-

-

29

tela

-

preservativo

30

-

-

preservativo

(*) los casos 13, 14 y 23 corresponden a manchas de sangre embebidas y secas en condiciones óptimas, ya que las dos primeras fueron recibidas en el Servicio de Huellas Digitales Genéticas con motivo del Control de Calidad Internacional de EDNAP (European DNA Profiling), y la restante fué obtenida y remitida por un Laboratorio Forense provincial a los efectos del análisis.

(**) en las muestras correspondientes a los casos 5, 16 y 25 se observa abundante fauna (larvas e insectos), lo cual presupone una conservación inadecuada.

3.2 Pelos

CASO NRO.

CANTIDAD

PRES. DE BULBO

1

5

SI: 1 / NO: 4

2

1

NO

3

2

NO

4

2

SI

5

5

NO

6

1

SI

7

7

SI: 1 / NO: 6

8

6

SI: 3 / NO: 3

9

5

SI

10

1

SI

11

1

SI

12

7

SI

13

4

SI

14

4

SI

TOTAL

51

SI: 30 / NO: 21

3.3 Uñas

Se recibieron siete casos que involucraban uñas provenientes de cadáveres.

3.4 Restos humanos

En colaboración con la Justicia Nacional y Juzgados Provinciales, se analizó material procedente de cadáveres en estado de descomposición diverso.

Muestras empleadas en el estudio comparativo de métodos de extracción de ADN (pK/SDS vs. CTAB).

TABLA V

MUESTRA Nro.

EDAD

A: adulto; B: feto/bebé

SEXO

M: masc.; F: fem.

ESTADO

(descomp. aparente)

1

B

F

+++

2

A

M

++

3

A

M

++

4

B

M

+

5

B

M

+++

6

A

M

+++

7

B

F

+

8

B

M

+

9

B

F

++

10

B

F

+++

11

A

M

++

12

A

F

+++

13

A

M

++

14

A

F

+

Muestras utilizadas en la determinación de la eficiencia del análisis en material cadavérico

TABLA VI

MUESTRA CADAVERICA.

NO INHUM.

FORMOLIZ.

INHUM. EN SUELO SECO

INHUM. EN SUELO HUM.

INHUM. EN NICHO

FETO/BEBE

7B

1H

1B

1S

2B

1B

5H

1B

NIÑO/ADULTO

5B

1Q

3B

2H

9H

1S

1M

Referencias: B: presencia de tejidos blandos; H: reducción completa (material óseo únicamente); Q: quemados; S: saponificado; M: momificado. Los números indican cantidad de cadáveres estudiados.

Material cadavérico procedente de desastres en masa:

Muestras obtenidas en el atentado a la Embajada de Israel.

NRO.

MAT. REMITIDO

COLOR

DESCOMPOS.

1

TND, pelos, grasa

negro y blanco

++

2

Piel, músculo

rojo

+

3

TND, tierra

negro

+++

4

TND, grasa

rosa y blanco

+

5

Piel

negro

++

6

TND

negro, blanco y rojo

++

7

TND

rojo

++

8

Grasa

blanco

+++

9

TND, pelo

gris y rojo

+++

10

TND

gris

+++

REFERENCIAS: TND: tejido no determinado.

+ a +++: descomposición aparente, de menor a mayor.

 Material procedente del atentado a la AMIA

TABLA VII

Nro.

Descripción

Estado

Tiempo de Colección

Identificado

(SI - NO)

1

Falanges Pie

Bueno

7 h(18/7)

SI

2

Utero y Falanges Pie

Bueno

6-7 h(18/7)

SI

3

Falanges Pie

Bueno

6-7h(18/7)

SI

4

Falange Pie

Bueno

(18/7)

SI

5

Hueso y Piel

Quemado 3ª

(18/7)

NO

6

Mùsculo y Hueso

Bueno

(18/7)

SI

7

Utero y Falanges Pie

Bueno

(18/7)

SI

8

Falanges, Piel, Músculo

Bueno

8-9 h(18/7)

SI

9

Cost., Músculo, Piel

Quemado 3ª

(18/7)

NO

10

Coxis, Músc., Piel

Bueno

8h (18/7)

NO

11

Coxis, Músc., Piel

Bueno

8h (18/7)

NO

12

Hueso, Músc.,Piel

Bueno

8h (18/7)

NO

13

Hueso, Músc.,Piel

Bueno

8h (18/7)

NO

14

Falanges, Piel, Músculo

Bueno

8-9h(18/7)

SI

15

Hueso, Músc.,Piel

Bueno

(18/7)

NO

16

Piel, Pelos

Bueno

(18/7)

NO

17

Musc.Hueso

Bueno

(18/7)

NO

18

Hueso, Músc.,Piel

Bueno

(18/7)

NO

19

Músc., Hueso

Bueno

(18/7)

SI

20

Músc.?, Piel

Descompuesto +

48h (20/7)

SI

21

Músc.?, Piel

Descompuesto +

48h (20/7)

NO

22

Falange, Musc., Piel

Descompuesto +

56h (20/7)

SI

23

Músc., Hueso

Descompuesto +

70h (21/7)

NO

24

Costilla

Descompuesto +

72h (21/7)

NO

25

Hueso. Músc.,Piel

Descompuesto +

72h (21/7)

NO

26

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto +

72h (21/7)

NO

27

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto +

(21/7)

NO

28

Hueso, Músculo

Descompuesto ++

(20/7)

NO

29

Vísceras

Descompuesto +

48h(20/7)

NO

30

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto +

4d(22/7)

SI

31

Músculo, Huesos

Descompuesto +

5d(23/7)

SI

32

Músculo, Huesos

Descompuesto +

6d(24/7)

SI

33

Huesos

Descompuesto +

6d(24/7)

SI

34

Músculo, Huesos

Descompuesto +

7d(25/7)

SI

35

Hueso, Músc., Piel

Descompuesto +

6d(24/7)

NO

36

Hueso, Músc., Piel

Descompuesto +

6d(24/7)

NO

37

Cuero Cab.

Descompuesto ++

S/Inf

NO

38

Hueso, Músc., Piel

Descompuesto +

6d(24/7)

NO

39

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto +

7d(25/7)

SI

40

Hueso, Pelo, Músc.,Piel

Descompuesto +

7d(25/7)

SI

41

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto ++

7d(25/7)

SI

42

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto +

7d(25/7)

SI

43

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto ++

7d(25/7)

SI

44

Hueso, Músc.

Descompuesto ++

7d(25/7)

NO

45

Hueso

Descompuesto ++

9d(27/7)

NO

46

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto ++

9d(27/7)

NO

47

Hueso Músc.,

Descompuesto ++

7d(25/7)

NO

48

Hueso, Músc.,Piel

Descomp. ++.Sap

8d(26/7)

NO

49

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto ++

8d(26/7)

NO

50

Hueso

Descompuesto +

7d(25/7)

NO

51

Hueso, Músc.

Descomp. +++

8d(26/7)

NO

52

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto ++

8d(26/7)

NO

53

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto ++

8d(26/7)

SI

54

Hueso, Músc.,Piel

Descompuesto ++

8d(26/7)

SI

55

Hueso, Músc.

Descomp. +++

8d(26/7)

NO

56

Dedos/ Pie

Descomp. +++

11d(28/7)

SI

57

Huesos, Piel

Descompuesto ++

8d(25/7)

SI

58

Músculo

Descompuesto ++

9d(27/7)

NO

59

Huesos

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

60

Pulmón

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

61

Músc.,Piel

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

62

Músc., Piel, Hueso

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

63

Piel

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

64

Hueso y Molar

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

65

Cuero Cab.

Descompuesto ++

S/Inf

S/Inf

66

Piel y Músculo

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

67

Musc., Pulmón, Vasos

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

68

Hígado

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

69

Músculo

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

70

Hígado

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

71

Tráquea, Pulmón

Descomp. +++

15d(2/8)

NO

72

Fragm. Maxilar c/diente

Descomp. +++

83d (5/10)

NO

73

Hueso, Músc., Cuero cab.

Descomp. +++

S/Inf

NO

74

Mat. amorfo no determ.

Descomp. +++

S/Inf

NO

 

Muestras obtenidas en un incendio de barco en Río Gallegos (Santa Cruz)

 Material cadavérico

MTRA.

DESCRIPCION

MTRA.

DESCRIPCION

1

Músculo pelvis

9

Coágulos

2

Músculo pelvis

10

Fragm. pulmón

3

Músculo pelvis

11

Fragm. hígado

4

Músculo tórax

12

Fragm. músculo

5

Maxilar

13

Hueso corto

6

Hueso corto

14

piel c/pelos

7

Fragmento hueso

15

Músculo pie

8

Músculo cardíaco

16

Fragm. músculo

 Muestras de sangre: anticoaguladas con EDTA, pertenecientes a supuestos familiares biológicos de los fallecidos.

Muestras correspondientes a un choque e incendio de ómnibus en Santo Tomé (Corrientes)

 Material cadavérico

Muestra

Detalle

Número

Detalle

1

Cabeza Femoral

11 a 13

2 Premolares y 1 incisivo

2

Huesos Cortos Pie

14 a 16

3 Molares

3

Huesos Cortos Pie

17

Huesos Carpo

4 y 5

Dos molares

18

Huesos Carpo

6

Un incisivo

19

Cabeza Humeral

7

Huesos Cortos Mano

20

Cuero Cabelludo y Pelo

8 y 9

Dos Incisivos

21

Un Premolar

10

Maxilar Inf.c/2 piezas dentarias

22

3er. Molar

 Muestras sanguíneas

Anticoaguladas con EDTA 5% (1/10 de volumen), pertenecientes a supuestos familiares biológicos de los fallecidos.

3.5 Reactivos

ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA

Se disuelven 38 grs de acrilamida y 2 grs de metilen-bis-acrilamida en agua destilada y se lleva a 100 ml de Vf.

BROMURO DE ETIDIO (solución)

Disolver 100 mg de bromuro de etidio en 10 ml de agua. Centrifugar y descartar el precipitado, tres veces. Conservar a 4 ºC. IMPORTANTE: poderoso mutagénico, usar guantes descartables.

BUFFER SIEMBRA 6X (gel agarosa)

Mezclar 3 ml de glicerol con 7 ml de agua destilada y agregar unos 25 mg de azul de bromofenol, agitando hasta disolución. Centrifugar a 10000 xg y descartar el precipitado.

CHELEX

Colocar 5 grs. de la resina Chelex p100 (Bio-Rad) en una probeta de 100 ml. Llevar a volumen con agua destilada y agitar. Conservar en heladera. Agitar vigorosamente antes de cada uso.

ClNa 3M

Disolver 174,9 grs de cloruro de sodio en agua destilada. Llevar a Vf 1000.

CLOROFORMO/ISOAMILICO

Mezclar 240 ml de cloroformo con 10 ml de alcohol isoamílico; agregar 1 volumen de agua destilada y agitar vigorosamente. Conservar en agua.

COLORANTE DESNATURALIZANTE

Mezclar 9,5 ml de formamida con 0,5 ml de agua y agregar una pizca de xilencianol y otra de azul de bromofenol. Agitar bien, centrifugar a 10000 xg y descartar el precipitado.

COLORANTE NO DESNATURALIZANTE

Preparar una solución saturada de sacarosa en agua y agregar una pizca de xilencianol y otra de azul de bromofenol. Agitar bien, centrifugar a 10000 xg y descartar el precipitado.

CTAB

Disolver 2 grs. de bromuro de cetil trimetil amonio en una solución constituída por 47 ml de ClNa 3M, 10 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 y 40 ml de EDTA 0,5M pH: 8, calentando ligeramente para favorecer el proceso. Agregar 0,2 ml de mercaptoetanol y ajustar a 100 ml de Vf.

DTT

Disolver 0,77 grs. de ditiotreitol en 5 ml de agua destilada estéril. Conservar a -20 ºC.

EDTA 5%

Disolver 5 gramos de EDTA disódico en 80 ml. de agua destilada, ajustar a 100 ml de volumen final. Conservar a 4 ºC.

EDTA 0,5M pH: 8

Disolver 186,1 gramos de EDTA disódico en 800 ml de agua destilada. Agregar lentejas de hidróxido de sodio hasta pH: 8, con agitación constante. Llevar a Vf: 1000 ml.

EtOH/AMONIO

Disolver 12 mg de acetato de amonio en 100 ml de etanol absoluto. Conservar en heladera.

FENOL (Solución)

Fundir a baño maría el fenol sólido y llenar hasta la mitad un frasco color caramelo con el líquido resultante. Agregar 1 volumen de TRIS/ClH 1M pH: 7,5, 0,2% de 2-hidroxi quinolina y 0,2% de mercaptoetanol. Agitar bien hasta que se forme una emulsión, decantar hasta observar las dos fases y descartar la parte acuosa. Agregar nuevamente TRIS/ClH 1M pH: 7,5 y repetir el proceso varias veces, hasta que la fase acuosa conserve su pH original (7,5). Conservar en solución de TRIS/ClH 0,1M.

FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2

Disolver 137,5 grs de fosfato disódico heptahidratado en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 7,2 con ácido fosfórico. Llevar a Vf: 1000 ml.

LUMI-PHOS 530

Constituído por 4- metoxi-4-(3-fenil fosfato) espiro (1,2 dioxietano-3,2' adamantano) en una solución 0,75 M de 2 amino 2 metil 1 propanol.

SOLUCION PARA PCR (no radiactiva)

La solución debe contener 50 mM ClK, 10 mM tris/Cl (pH 8,3), 1,5-2,5 mM cloruro de magnesio, 1,0 uM de cada "primer" y 200 uM de cada dNTPs.

SOLUCION PARA PCR (radiactiva)

Similar a la anterior, excepto que la concentración de dATP debe ser de 20 uM en vez de 200 uM.

NaOH 1M

Disolver 40 grs de hidróxido de sodio en lentejas en 1 litro de agua destilada.

PROTEINASA K (solución)

Disolver 100 mg de proteinasa K liofilizada en 5 ml de agua destilada estéril.

SDS 10%

Disolver 100 grs de dodecil sulfato de sodio en 900 ml de agua caliente. Ajustar a pH 7,2 por agregado de unas gotas de ácido clorhídrico concentrado. Llevar a Vf: 1000 ml.

SOLUCION DE UNION

A 1 ml de etanol agregarle 5 ul de ácido acético glacial y 3 ul de "bind silane" (Promega). Mezclar por agitación.

SOLUCIONES PARA HLA-DQalfa.

1) BUFFER CITRATO

Disolver 18,4 grs de citrato de sodio trihidratado en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 5 con ácido cítrico monohidrato (unos 6 grs.). Llevar a Vf: 1000 ml.

2) 20X SSPE

Disolver 7,4 grs de EDTA disódico dihidrato en 800 ml de agua destilada. Agregar NaOH 10N hasta pH 6. Añadir 210 grs de ClNa y 27,6 grs de fosfato diácido de sodio monohidrato. Ajustar a pH 7,4 con unos 10 ml de NaOH 10N. Llevar a Vf: 1000 ml.

3) CROMOGENO

Agregar 30 ml de etanol absoluto al frasco que contiene tetrametilbencidina (Perkin-Elmer). Mantener en heladera, al abrigo de la luz y el aire.

4) AGUA OXIGENADA 3%

Agregar 0,3 ml de peróxido de hidrógeno 100 v a 9,7 ml de agua destilada.

5) SOLUCION DE HIBRIDIZACION

Para 8 muestras, mezclar 7 ml de 20X SSPE y 1,4 ml de SDS 10%. Llevar a 28 ml con agua destilada.

6) SOLUCION DE LAVADO

Mezclar 25 ml de 20X SSPE y 2 ml de SDS 10%. Llevar a 200 ml con agua destilada.

7) SOLUCION DE COLOR

Preparar inmediatamente antes del uso. Mezclar 80 ml de BUFFER CITRATO, 80 ul de AGUA OXIGENADA 3% y 4 ml de CROMOGENO.

SOLUCIONES PARA TRATAMIENTO DE MEMBRANAS CARGADAS

1) SOLUCION DE PREHIBRIDIZACION

Agregar 10 ml de SDS 10% a un litro de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2.

2) MEZCLA DE HIBRIDIZACION

Disolver 10 grs. de caseína de Hammersten y 0,2 grs de azida sódica en un litro de "solución de prehibridización".

3) SOLUCION DE LAVADO

A 800 ml de agua destilada agregarle 10 ml de SDS 10% y 2 ml de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2. Llevar a Vf: 1000 ml.

4) LAVADO FINAL

Preparar una solución 3,25M de 2-amino-2-metil-1-propanol y 4,4 mM de cloruro de magnesio.

5) SOLUCION DE DESHIBRIDIZACION

A 50 ml de agua destilada agregar 0,1 ml de SDS 10% y 2,5 ml de PROTEINASA K (solución). Llevar a 100 ml.

SOLUCIONES PARA TRATAMIENTO DE MEMBRANAS NEUTRAS

1) MEZCLA DE PREHIBRIDIZACION/HIBRIDIZACION

Agregar 5 ml de TWEEN 20 a un litro de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2. Disolver en la solución resultante 10 grs. de caseína de Hammersten y 0,2 grs de azida sódica.

2) SOLUCION DE LAVADO

A 800 ml de agua destilada agregarle 5 ml de TWEEN 20 y 100 ml de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2. Llevar a Vf: 1000 ml.

3) LAVADO FINAL

Mezclar 10 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 con 50 ml de ClNa 3M. Llevar a Vf: 1000 ml.

SSC 20X Disolver 175,3 grs de ClNa y 88,2 grs de citrato de sodio en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 7 con NaOH 10M. Llevar a Vf: 1000 ml.

TBE 10X Disolver 108 grs de tris base, 55 grs de ácido bórico y 7,4 grs de EDTA disódico en agua destilada. Llevar a Vf: 1000 ml.

T10E1 Mezclar 1 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 con con 0,2 ml de EDTA 0,5M pH: 8. Llevar a 100 ml con agua destilada.

T10E10 Mezclar 1 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 con con 2 ml de EDTA 0,5M pH: 8. Llevar a 100 ml con agua destilada.

TEC Mezclar 100 ml de T10E10 con 3,3 ml de ClNa 3M.

TINCION CON PLATA

Solución detenedora: Llevar 200 ml de ácido acético glacial a 2 lts. con agua destilada.

Solución de tinción: Disolver 1 gr de nitrato de plata en 2 lts. de agua destilada. Agregar 3 ml de formaldehído. Preparar en el día de uso.

Solución reveladora: Disolver 60 grs de carbonato de sodio anhidro en 2 lts de agua destilada y enfriar en heladera. Inmediatamente antes del uso, agregar 3 ml de formaldehído y 400 ul de tiosulfato de sodio 10 mg/ml.

TRIS/ClH 1M pH: 7,5

Disolver 121,1 gramos de tris base en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 7,5 por agregado de ácido clorhídrico concentrado. Llevar a Vf: 1000 ml.

4 Metodos

4.1 Procedimientos de extraccion de adn:

Métodos que emplean proteinasa K/SDS.

Procedimiento seguido para extraer manchas de sangre.

Las manchas sobre tela o papel (3 mm2 de superficie) se resuspenden en 2 ml de TEC.

Se agrega 10 ul de Proteinasa K y 200 ul de SDS 10%.

Se incuba a 37 ºC durante 12 horas.

Las muestras se tratan con solventes orgánicos: dos veces con fenol y dos con Cloroformo/Isoamílico, recuperándose cada vez la fase acuosa. Este procedimiento permite extraer las proteínas y lípidos que impurifican el material genético.

Se agrega 1/10 de volumen de ClNa 3M y dos volúmenes de EtOH absoluto y centrifugan a 10000 xg. a efectos de precipitar el ADN.

Los precipitados son resuspendidos en T10E1 o en agua destilada.

Procedimiento seguido para extraer ADN a partir de muestras de sangre congelada.

Se parte de 3 ml de sangre congelada.

Las muestras congeladas son hemolizadas por calentamiento brusco a 42 ºC durante 20 minutos. Los glóbulos blancos son lavados por resuspensión y centrifugación con T10E10 hasta que se observa un pellet blanco (2 ó 3 lavados), libre de hemoglobina y pigmentos. El precipitado es resuspendido en 0,5 ml de TEC, adicionándose 5 ul de proteinasa K y 50 ul de SDS 10%; las muestras son incubadas a 37 ºC durante 12 horas. Los siguientes pasos son idénticos a los detallados anteriormente.

Extracción diferencial de ADN a partir de muestras combinadas (semen-sangre; semen-células de descamación).

Esta técnica requiere un paso intermedio mediante el cual es mayoritariamente eliminado el material proveniente de la víctima, enriqueciéndose proporcionalmente de esta forma la cantidad neta de ADN presente en las cabezas espermáticas.

Paso 1: separación del material de la víctima mediante digestión con pK/SDS/TEC e incubación durante 2 horas a 56 ºC: bajo estas condiciones las cabezas de los espermatozoides son resistentes al ataque proteolítico y del agente caotrópico. Se centrifuga a 13000 xg durante 10 minutos y retira el sobrenadante, que contiene ADN de la víctima.

Paso 2: El precipitado del paso anterior (espermatozoides), se resuspende nuevamente en pK/SDS/TEC y agregan 10 ul de DTT, un agente que permeabiliza la cabeza del espermatozoide. Se incuba a 56 ºC durante 12 horas.

Finalmente, con los líquidos obtenidos de ambos pasos, se procede a las extracciones con solventes orgánicos y precipitación del ADN como se indicara anteriormente.

En caso de tratarse de muestras de semen únicamente, no se realiza el "paso 1" (separación del material de la víctima).

Procedimiento rápido para la extracción de ADN a partir de sangre entera, semen, o manchas (micrométodo), aplicable al análisis por PCR:

Se desarrolló un método rápido y económico que parte de 30 microlitros de sangre, 5 ul de semen o de una porción de 4x4 mm de tela manchada, se incuba con 0,4 ml de TEC; 5 ul de pK y 40 ul de SDS 10 % (si se trata de semen, añadir además 5 ul de DTT), durante 20 min. a 60 ºC.

Se extrae sucesivamente con 1 ml de fenol y 1 ml de cloroformo.

Se agrega 1/10 de volumen de ClNa 3M y 2 volúmenes de etanol, centrifuga a 13000 xg durante 4 min., descarta el sobrenadante y resuspende en agua destilada.

Extracción de ADN con CTAB (material cadavérico).

Fue empleada la técnica de extracción mediada por la sal de amonio cuaternaria (Bromuro de Cetil Trimetil Amonio) (Corach, 1991), usada en nuestro laboratorio para extracciones de ADN a partir de diversas fuentes.

Los concentrados de glóbulos blancos o soportes conteniendo las manchas a ser analizadas son resuspendidos en 0,5 a 1 ml de solución de lisis CTAB (dependiendo del tamaño de la muestra).

Las muestras son incubadas durante 3 horas a 60 ºC.

Se extraen dos veces con Cloroformo/Isoamílico y precipitan con 2/3 de volumen de alcohol isopropílico.

El precipitado obtenido es lavado con EtOH/amonio.

Las muestras se resupenden en T10E1.

Extracción mediante resinas de intercambio iónico para ADN monocadena

Se colocan 3 ul de sangre, de semen o una porción manchada de tela o papel de 3x3 mm en 1,5 ml de agua destilada estéril.

Se incuba a temperatura ambiente 15 a 30 minutos y centrifuga a 13000 xg 2 ó 3 minutos.

Al precipitado resultante se le añaden 180 ul de solución de Chelex y 5 ul de DTT (éste último sólo para semen), e incuba a 56 ºC por 15 a 30 min.

Se hierve a 8 min y centrifuga nuevamente a 13000 xg, 2 a 3 min.

Para cada amplificación, se emplean 10 ul del líquido resultante.

Obtención de ADN para análisis por PCR mediante shock osmótico.

Se mezclan 2 ul de sangre entera y 8 ul de agua bidestilada estéril. Se utiliza 1 ul como templado para cada reacción de PCR.

Extracción mediante isotiocianato de guanidina.

Se agregan 100 ul de sangre entera a 1 ml de solución de isotiocianato de guanidina (DNAzol, GibcoBRL) y agita durante 2 minutos.

Centrifugar a 10000 xg 10 minutos y descartar el precipitado, constituído por restos celulares.

Recuperar el sobrenadante y precipitar el ADN con etanol como se indicara anteriormente.

4.2 Purificacion del adn aislado:

Se emplearon los siguientes sistemas alternativos de eliminación de impurezas:

Precipitación salina: Se agregan 2 volúmenes de etanol/amonio, centrifuga a 13000 xg, y resuspende el ADN en agua bidestilada estéril.

Diálisis: Las bandas obtenidas por electroforesis en geles de agarosa y visualización con bromuro de etidio, se cortan y colocan en bolsas de diálisis juntamente con buffer TBE. Se efectúa la electroelución a 300 v, 1 a 3 hs., con 1 minuto adicional invirtiendo la polaridad. La solución obtenida se extrae con solventes orgánicos y precipita como fuera descripto anteriormente para la extracción de ADN a partir de manchas de sangre. Si el volumen es grande, se concentra con sec-butanol, que deshidrata la solución acuosa.

Sistemas de purificación basados en la adsorción del ADN a sílica:

 En "batch": se añade a la muestra 3 volúmenes de ioduro de sodio 6 M y 5 ul de suspensión de sílica (GENECLEAN II, BIO 101 Inc, La Jolla, CA) en agua, se agita y coloca en baño de hielo durante 5 minutos. Se centrifuga, descarta el sobrenadante y lava el precipitado varias veces con etanol 70 %. Finalmente, se recupera el ADN agregando 30 ul de agua e incubando a 55 ºC durante 3 min.

 Por filtración: se agrega a la muestra 4,5 volúmenes de ioduro de sodio 6 M y la solución resultante se filtra a través de una membrana de sílica (GlassMAX DNA Isolation Spin Cartridge System, GIBCO, USA). Se centrifuga a 13000 g y lava repetidas veces con etanol 70 % a 4 grados centígrados, centrifugándose cada vez hasta la desaparición del líquido. El ADN se eluye agregando 40 ul de agua a 65 ºC y centrifugando durante 20 segundos.

4.3 Cuantificacion del adn purificado:

Se utilizaron cuatro métodos alternativos: Absorción de luz ultravioleta: Se efectuó a partir de diluciones 1/200 a 1/500 en agua destilada, para determinar la absorción de luz UV a las longitudes de onda 230, 260, 280 y 320 nm en un espectrofotómetro Gilforg 250. Las relaciones 260/280 y 260/230 permitieron detectar la presencia de posibles contaminantes en las muestras. Se calcula el contenido de ADN asumiendo que una unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 50 ug/ml de ADN doble cadena.

Agarosa/bromuro de etidio: Se utilizó un gel de agarosa al 1% en buffer TBE, con solución de bromuro de etidio y posterior corrida electroforética con el gel sumergido en TBE/bromuro de etidio, 20 minutos a 4 v./cm.

Se observa al UV en transiluminador y compara la intensidad de la fluorescencia con la emitida por testigos de concentración conocida.

Sistema colorimétrico: Consiste en colocar 1 ul de muestra sobre una banda de nylon y sumergir la misma sucesivamente en soluciones que generan una reacción de color con los ácidos nucleicos (ADN y ARN) (FastCheck Nucleic Acid Quantificaction System, GIBCO, USA). Finalmente, se compara la señal producida con estándares de concentración conocida.

Hibridización con sondas humano-específicas: Se llevó a cabo por hibridización de la muestra que contiene ADN, fija en una membrana de nylon, con la sonda D17Z1 (Walsh et al, 1992), marcada con fosfatasa alcalina y visualización con Lumiphos 530 (ver "hibridización").

Los resultados obtenidos se comparan con diluciones decrecientes de un patrón de ADN de concentración conocida.

4.4 Analisis de adn de alto peso molecular

Corte del ADN con enzimas de restricción:

- Se agrega a una solución que contiene 1-10 ug de ADN, un volumen de agua destilada suficiente para obtener un volumen final de 150 ul, descontando 15 ul de tampón (buffer provisto por el fabricante de la enzima), que se agrega a continuación, y 50 unidades (aprox. 5 ul) de la enzima de restricción a ser empleada. Las más frecuentemente usadas en el campo de la identificación son: Hae III, Hinf I o Pst.

- Se incuba a 37 ºC durante 3 horas.

- Se lleva a 0,3 M de ClNa y 70 % de etanol.

- Se coloca 1 hora a -70 ºC, centrifuga y resuspende en 10 ul de agua destilada.

Evaluación del corte del ADN:

Se efectúa mediante un gel de agarosa al 1 %, teñido con bromuro de etidio, similar al empleado en "cuantificación de ADN", y comparando el resultado obtenido con un testigo de ADN cortado con la misma enzima.

Separación electroforética:

- Se prepara un gel de agarosa al 0,8 % en TBE y siembran las muestras, reservando algunos caminos para los marcadores de peso molecular conocido y controles internos como el denominado K562.

- Se corre 16 horas o 24 horas (dependiendo de las sondas que serán usadas posteriormente), a 40 volts en geles de 20 cm. de longitud.

- Se colorea con bromuro de etidio y fotografía al UV.

Transferencia del ADN a soportes sólidos (técnica de Southern):

Para membranas con carga positiva:

- Se arma el dispositivo consistente en un recipiente plástico que contiene NaOH 0,5 M/ ClNa 0,5 M (solución de transferencia), sobre el cual se coloca una placa de vidrio y encima de ésta, una tira de papel Whatman 3MM que pesca en el líquido. Sucesivamente, se ubica el gel, una membrana de nylon cargada positivamente (BIODYNE B, Gibco BRL), papeles de filtro cortados del tamaño del gel, servilletas de papel y por último, una placa pesada.

En estas condiciones, se producen simultáneamente la desnaturalización del ADN por efecto de la solución alcalina y su transferencia del gel a la membrana, debido a la fuerza ascendente del líquido por capilaridad, que "arrastra" al material genético.

- Se transfiere durante 16 horas.

- La membrana se lava con 2xSSC, dos veces.

Para membranas neutras

- Se requiere un paso previo a la transferencia, que consiste en desnaturalizar el ADN contenido en el gel con 1,5M ClNa / 0,5M NaOH durante 15 minutos.

- Enjuagar con agua destilada y neutralizar con 1,5M ClNa / 0,5M Tris (2 lavados de 15 minutos cada uno).

- Se arma un dispositivo similar al anterior, pero empleando un membrana neutra (BIODYNE A, Gibco BRL) y 10x SSC como solución de transferencia.

- Se transfiere durante 16 horas.

- Tratar la membrana con 0,2M Tris / 2x SSC (2 lavados de 15 minutos c/u).

- Exponer al UV durante 40 segundos y hornear a 80 ºC 30 minutos, a los efectos de fijar el ADN a la membrana.

Sondas empleadas en el presente trabajo.

Radiactivas

- De locus múltiple: M13 (Vassart et al, 1987).

- De locus único: YNH24 (Nakamura et al, 1987) (locus D2S44).

Marcación por "Random Primers":

- Desnaturalización del inserto (aislado previamente de la construcción por clivaje con Eco R1) en baño de agua hirviendo durante 5 minutos.

- Agregado de 2 ul de dATP, dGTP y dTTP, 15 ul de buffer (provisto por BRL), y 5 ul de 32P-dCTP, llevando a un volumen final de 49 ul con agua destilada, para agregar finalmente 1 ul de fragmento klenow.

- Incubación a 25 ºC 1 hora.

- Agregado de 5 ul de EDTA 0,5m para detener la reacción y separación mediante una columna de Sephadex G-50 Medium.

- Desnaturalización con NaOH 1,5 M durante 10 minutos.

- Neutralización con ClH 1,5 M.

Quimioluminiscentes:

Se utilizaron las siguientes sondas de locus específico, a las que se les ha incorporado al nucleótido en 5', previamente modificado por el agregado de un grupo amino, una molécula de fosfatasa alcalina:

SONDA

Locus

Ref.

YNH-24

D2S44

Promega (USA)

LH-1

D5S110

GIBCO, BRL

PH-30

D4S139

GIBCO, BRL

MS-1

D1S7

GIBCO, BRL

Hibridización y detección:

Métodos radiactivos:

- Se lleva a cabo una "prehibridización", incubando la membrana en una solución que contiene 0,25 % de leche en polvo descremada y 6xSSC, toda la noche a 55 ºC.

- Se agrega la sonda marcada con 32P y deja 16 hs. a 55 ºC (para la sonda M13) o a 60 ºC (para YNH-24), lavándose posteriormente con soluciones de 2xSSC / 0,1% SDS, luego 1x SSC y finalmente 0,5x SSC, manteniendo constante la concentración de SDS; controlando cada paso con un monitor Geiger-Müller.

- Se coloca la membrana en contacto con una película radiográfica, durante 16 horas a -70 grados, al cabo de las cuales se procede al revelado y evaluación de los resultados obtenidos.

Deshibridización:

- Lavar la membrana dos veces con agua destilada, a 90 ºC.

Métodos quimioluminiscentes:

Para membranas cargadas:

- Colocar la membrana en contacto con la "solución de prehibridización" a 55 ºC, 20 minutos, con agitación.

- Reemplazar el líquido por la "mezcla de hibridización" y agregar la/s sonda/s (habitualmente, una de "locus único" y otra de un "ladder" de peso molecular) marcada/s con fosfatasa alcalina. Incubar a 55 ºC durante 10 a 30 minutos (el tiempo depende de la sonda utilizada).

- Tratar dos veces con "solución de lavado", 10 minutos c/u a 55 ºC y dos veces con "lavado final", 10 minutos c/u a temperatura ambiente.

- Se escurre la membrana sobre papel Watmann 3MM, coloca entre dos hojas de polietileno y agrega 1 ml de LUMIPHOS 530 (Gibco, BRL).

- Se expone a una placa radiográfica durante 1 hora y revela.

Deshibridización:

- Incubar la membrana con "solución de deshibridización", 1 hora a 65 ºC.

- Lavar dos veces a temperatura ambiente con 0,1% SDS / 5x SSC.

- Incubar en formamida 50% / 10 mM fosfato de sodio, a 65 ºC 1 hora.

- Lavar dos veces con 2x SSC, a temperatura ambiente (conservar húmeda hasta el resondeo).

Para membranas neutras:

El protocolo para la hibridización es similar, pero cambia la composición de las soluciones (ver capítulo "Reactivos", del presente trabajo).

Deshibridización:

- Incubar la membrana 30 minutos a 65 ºC, en 0,1% SDS.

- Humedecer con 2x SSC y conservar en esas condiciones hasta el resondeo.

4.5 Analisis de adn en condiciones variables de degradacion: los métodos de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).

Preparación de la muestra:

- Se coloca en cada tubo 30 ul de "mezcla para PCR" (radiactiva o no, según se desee).

- Se agrega una porción de muestra que contenga de 1 a 50 nanogramos de ADN (1 a 3 ul) y 1,5 U de Taq polimerasa.

- Cuando se emplean métodos radiactivos, se adiciona finalmente 1 uCi de 32P-dATP.

Marcadores empleados en el presente trabajo

 Ubicados en los cromosomas autosómicos

Nombre

Locus

Nro. de

variantes

Ref

D1S80

D1S80

26

Budowle et al, 1991

HUMTHO-1

11p15.5

5

Edwards et al, 1991

HUMFABP

4q31

7

Edwards et al, 1991

HUMFES/FPS

15q25-qter

6

Hammond et al, 1994

HUMVWA

12p12-pter

7

Kimpton el al, 1992

HUMRENA4

1q32

4

Edwards et al, 1991

D6S366

6q21-qter

10

Hammond et al, 1994

CSF1PO

5q33.3-34

10

Hammond et al, 1994

F13A1

6p24-25

14

Hammond et al, 1994

TPOX

2p23-2pter

8

Budowle et al, 1995

HUMCD4

12p-12pter

10

Hammond et al, 1994

HUMMBPA/B

18q-23pter

10/8

Polymeropoulos, 1992

HLA-DQalfa

DQ

6

Saiki et al, 1986

 Ubicados en los cromosomas sexuales

Nombre

Locus

Nro. de

variantes

Ref

HUMHPRTB

Xq26

7

Edwards et al, 1991

HUMARA

Xcen-q13

17

Edwards et al, 1991

DYS19

G00-121-409

5

Roewer et al, 1992

DYS385

G00-316-257

49

Kayser et al, 1997

DYS389I

G00-366-108

7

Kayser et al, 1997

DYS389II

G00-366-108

9

Kayser et al, 1997

DYS390

G00-366-115

10

Kayser et al, 1997

DYS391

G00-366-118

6

Kayser et al, 1997

DYS392

G00-456-509

8

Kayser et al, 1997

DYS393

G00-456-649

5

Kayser et al, 1997

YCA II

G00-433-599

28

Kayser et al, 1997

Y

Yq13-qter

1

Nakahori et al, 1986

Nota: para los marcadores del Y se menciona su ubicación en el GDB-ID.

Condiciones de amplificación:

La amplificación se efectúa mediante varios ciclos, cada uno de los cuales consta de desnaturalización (se separan las cadenas del ADN), reasociación (se produce la unión de los iniciadores o "primers" a las secuencias complementarias) y extensión (se sintetizan nuevas moléculas de ADN).

 Para todos los sistemas, excepto HLA-DQ, D1S80 e YCA II, se emplea el siguiente ciclado:

- 94 ºC 1 min.; 60 ºC 1 min.; 70 ºC 1,5 min.: 10 ciclos.

- Luego 90 ºC 1 min.; 60 ºC 1 min.; 70 ºC 1,5 min.: 20 ciclos.

 Para HLA-DQ: 94 ºC 60 seg.; 60 ºC 30 seg.; 72 ºC 30 seg.: 32 ciclos. Luego, una extensión final de 7 min. a 72 ºC.

 Para D1S80: 95 ºC 10 seg.; 67 ºC 10 seg.; 70 ºC 30 seg.: 27 ciclos.

 Para YCA II: 94 ºC 60 seg.; 45 ºC 60 seg.; 72 ºC 90 seg.: 30 ciclos.

Electroforesis (todos los sistemas excepto HLA-DQ):

 Para todos los sistemas, excepto D1S80:

Se prepara un gel de poliacrilamida (PAGE) desnaturalizante, del siguiente modo:

- Tratar una de las placas de cristal con silicona (SigmaCote u otras), con ayuda de toallas de papel, y secar cuidadosamente.

- Para una cuba modelo S2 (Gibco BRL), mezclar 49,5 grs. de urea, 46 ml. de agua destilada y 5 ml. de TBE 10x. Disolver con calentamiento suave y agitación. Añadir 10 ml. de solución de acrilamida/bisacrilamida 38:2.

- Finalmente, agregar los catalizadores: 200 ul de persulfato de amonio 10% y 32 ul de TEMED. Mezclar bien y volcar en menos de 2 minutos entre dos placas de cristal (una de ellas siliconada, como se indicó antes), cuidando que no queden burbujas.

Se deja solidificar durante una hora y coloca en una cuba vertical con buffer TBE 0,5X, a 60 mA (con voltaje y wattaje libres) unos 30 minutos.

A la muestra se le agrega 1 volumen de "colorante desnaturalizante" y se siembra en las cavidades del gel. La corrida electroforética se efectúa durante 60-90 minutos, según el peso molecular de los productos de amplificación, en las condiciones mencionadas.

 Para D1S80:

Se prepara un gel de poliacrilamida no desnaturalizante del siguiente modo:

-Tratar una de las placas de cristal con "solución de unión" y esparcirla mediante toallas de papel absorbente, retirando el exceso hasta que quede totalmente seco.

-Tratar la otra placa con silicona, con ayuda de toallas de papel y secar cuidadosamente. Evitar que cada una de las placas entre en contacto con la otra, a través de las toallas, manos, esponjas, etc., ya que ello provocaría la adhesión parcial y rotura del gel.

-Para un gel de 19,5 cm x 37 cm, mezclar 30 ml de agua destilada, 2 ml de TBE 10x y 8 ml de solución de acrilamida (GeneAmp Detection Gel, Perkin-Elmer).

-Agregar 120 ul de persulfato de amonio 10% y 20 ul de TEMED. Volcar antes de 2 minutos y dejar solidificar por una hora.

-Se mezclan 5 ul de amplificado con 1 ul de "colorante no desnaturalizante" y se siembra en las cavidades del gel. La corrida electroforética se efectúa durante 90 minutos.

Visualización de los resultados:

 Métodos radiactivos:

Los resultados se visualizan mediante autorradiografía, colocando una placa radiográfica KODAK OMAT en contacto con el gel, adherido a un papel de filtro. La exposición se efectúa a -70 ºC, durante un lapso que puede variar, según la intensidad de la señal, entre 2 hs. y 3 días.

 Métodos no radiactivos (todos los sistemas excepto HLA-DQ):

Tinción con bromuro de etidio: se sumerge el gel en una solución de TBE 0,5X con 0,01 mg % de bromuro de etidio. Se observa la flourescencia emitida por los ácidos nucleicos al UV.

Tinción con nitrato de plata: es conveniente adherir previamente el gel a la placa de cristal, como se indicó antes.

El tratamiento consiste en:

- Separar las placas, observando que el gel se adhiere a la más corta.

- Colocarla en 1 litro de "solución detenedora", unos 20 minutos con agitación (esta etapa puede prolongarse hasta varias horas, si se desea). Reservar el líquido para el último paso.

- Lavar con agua destilada, tres veces de 2 min. c/u, escurriendo bien cada vez.

- Agregar la "solución de tinción", agitando durante 30 minutos.

- Lavar el gel muy brevemente, no más de 5 segundos, con agua destilada, y agregar la mitad de la "solución reveladora". Agitar hasta que las bandas comienzan a hacerse visibles.

- Descartar el líquido y agregar la otra mitad de la "solución reveladora". Dejar 2-3 min. y descartar.

- Lavar con agua destilada 2 min. y agregar la "solución detenedora".

- Lavar el gel dos veces con agua destilada y secar. Fotocopiar, fotografiar o levantar con "scanner" para almacenar los resultados.

 Hibridización y detección de HLA-DQ:

- Incubar los amplificados a 95ºC, de 3 a 10 minutos.

- Colocar una tira en cada canaleta de la bandeja provista (Perkin-Elmer).

- Preparar por cada muestra 3,3 ml. de solución de hibridización con 27 ul de enzima conjugada (Perkin-Elmer) y colocar 3 ml de mezcla en cada canaleta.

- Agregar 35 ul de cada amplificado a cada tira, e incubar a 55ºC, 20 minutos.

- Retirar todo el líquido de cada canaleta y agregar 10 ml de solución de lavado. Incubar a 55ºC, 12 minutos.

- Retirar el líquido y agregar otros 10 ml, incubando a temperatura ambiente 5 minutos.

- Agregar 10 ml de solución de color. Incubar a temperatura ambiente hasta que los puntos azules se observen nítidamente.

- Retirar el líquido y lavar 3 veces con agua destilada (10 min. c/u), a temperatura ambiente.

- Secar las tiras y fotocopiar con láser color para preservar los resultados.

Evaluación de la eficiencia del análisis

La eficiencia fué determinada como:

nro. de sistemas con resultado positivo x 100

nro. total de sistemas empleados

4.6 Desarrollo de sistemas "multiplex" de aplicacion forense.

Se seleccionaron aquellas combinaciones de sistemas compatibles en base al peso molecular del amplificado, composición de iniciadores o "primers" y condiciones de ciclado, que permitieran su amplificación en una sola mezcla de reacción.

La puesta a punto se realizó mediante experimentos sucesivos en diferentes condiciones de:

 Concentración de magnesio (de 1 a 2,5 uM).

 Ciclado, empleándose alternativamente el mencionado anteriormente (ver el punto "Condiciones de amplificación") y el propuesto por Edwards et al (1991).

 Concentración de cada iniciador o "primer" (0,1uM, 1 uM y 10 uM).

Combinaciones empleadas:

 HUMFES / HUMVWA

 HUMTHO1 / HUMFABP / HUMHPRTB

 DYS 390 / DYS 391

 DYS 392 / DYS 393

 Determinación de sexo y caracterización parcial de muestras de interés forense: se combinaron los sistemas polimórficos HUMHPRTB (1 uM), DYS19 (1 uM) y el monomórfico Y (0,01 uM).

Uno de los sistemas polimórficos se encuentra ubicado en el cromosoma X (HUMHPRTB) y el otro en el cromosoma Y (DYS19). El sistema monomórfico se halla también en el cromosoma Y.

La amplificación del DYS19 y la observación de una sola banda en el HUMHPRTB (hemicigosis) confirman el origen masculino de la muestra; por el contrario, la ausencia de amplificación del primero y dos bandas en el segundo corresponden indudablemente a una mujer.

A los efectos de confirmar el sexo del individuo, se analiza simultáneamente con los anteriores una secuencia específica del cromosoma Y, altamente sensible, útil principalmente en los casos de mujeres homocigota para HUMHPRTB.

Los sistemas combinados se resumen en el siguiente cuadro:

SISTEMA

LOCUS

Nro. variantes

HUMHPRTB

Xq26

7

DYS 19

No determinado

4

Y

Yq13-qter

1

Mezcla de amplificados

Con sistemas incompatibles en cuanto a alguna o todas las condiciones mencionadas anteriormente, pero cuyos productos de amplificación poseen diferente peso molecular, se mezclaron los mencionados productos a los efectos de sembrar las muestras amplificadas mediante distintos sistemas en un sólo punto ("multiloading"). Por ejemplo, es factible la mezcla del dúplex DYS390/DYS391 con el sistema YCAII, que poseen diferente ciclado, ahorrándose un camino del gel de poliacrilamida.

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Colección: Derecho, Economía y Sociedad

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Última modificación: 09 de Marzo de 2007

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