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Regulación jurídica de las biotecnologíasCurso dictado por la Dra. Teodora Zamudio Equipo de docencia e investigación UBA~DerechoActualidad | Normativa | Jurisprudencia | Doctrina |Enlaces |Mapa de carpetas |
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NOTA: La evaluación de la cantidad comparativa de ADN obtenido se efectuó mediante el método que emplea bromuro de etidio. El ADN extraído de sangre y de semen, con diferentes métodos, arrojó como resultado que los que emplean proteinasa K / SDS, incluyendo el micrométodo, permiten una mayor recuperación del ácido nucleico que los que utilizan CTAB, posibilitando tanto una eficiente amplificación por PCR como una adecuada evaluación mediante Southern blot. Las razones de este mayor rendimiento podrían hallarse en que los métodos enzimáticos, con la acción simultánea de proteasas como la mencionada y el detergente SDS, son más drásticos que los que emplean solamente un detergente (el CTAB), destruyendo completamente las estructuras celulares. Sin embargo, esta situación también incrementa notablemente el nivel de impurezas que coprecipitan con el ADN, requiriendo en algunos casos tratamientos adicionales de purificación. El micrométodo presenta las mismas ventajas y limitaciones, pero permite la obtención de material analizable por PCR en apenas una hora, desde el momento de la toma de muestra, a diferencia de los restantes métodos que requieren varias horas. La extracción mediante chelex, si bien es un proceso rápido y sencillo, sólo aísla ADN monocadena útil para PCR, pero persiste en la solución que contiene el ácido nucleico un alto nivel de impurezas, que en algunos casos dificulta el proceso de amplificación. Fluídos biológicos en soportes sólidos. Manchas de sangre: El ADN extraído de sangre en diferentes soportes, arrojó como resultado que el vidrio permite una mayor recuperación del ácido nucleico, seguido por el papel de diario y la tela de algodón. El paso del tiempo en las manchas secas no mostró reducción en el rendimiento de la extracción, como tampoco una diferencia notable en cuanto a la presencia de ADN de bajo peso molecular (degradado). Los resultados obtenidos se expresan en la tabla IX. TABLA IX
La más eficiente recuperación de ADN en manchas sobre una superficie lisa, no porosa, como el vidrio, se explica por cuanto permite mantener una mayor integridad de las células, evitando fenómenos de adsorción, absorción y reacción química con los componentes del soporte, tanto más factibles cuanto más poroso es éste. Tal lo ocurrido con la tela de algodón, y en menor medida, con el papel de diario. Mezclas de semen/sangre: La técnica implementada resultó altamente satisfactoria para la separación del ADN correspondiente a la sangre, del ADN proveniente del semen. Ello se comprobó al observarse cuatro alelos, dos en cada etapa de la separación, correspondientes a los dos individuos donantes de los fluídos. La cantidad relativa de ADN aislado en cada etapa se esquematiza en la tabla X. TABLA X
A partir de la muestra 3 (que contiene 50 ul de semen), fué posible aislar suficiente ADN seminal como para hacer posible su evaluación con sondas de locus único. La evaluación del ADN obtenido del semen es posible por cuanto se observa con sondas de locus único como bandas mucho más intensas que las provenientes de la sangre, apenas perceptibles, por lo cual resulta de gran utilidad en la identificación de individuos responsables de casos de violación. El método se fundamenta en que en la primera etapa, de hidrólisis enzimática suave, sólo son afectadas las células de la víctima (no espermáticas), cuyo ADN se aísla y purifica, separándose por centrifugación los espermatozoides. En la segunda etapa, una hidrólisis drástica, que utiliza un tiol como permeabilizante, destruye los espermatozoides liberando su ADN. Muestras obtenidas de casos reales Una vez evaluada la capacidad de cada uno de los métodos de aislamiento de ADN con muestras obtenidas de donantes, se procedió a su empleo en muestras forenses provenientes de hechos reales, en cooperación con Poderes Judiciales de la Nación y Provinciales. Muestras forenses provenientes de violaciones Se analizaron manchas e hisopados conteniendo mezclas de semen y fluídos no seminales a los efectos de evaluar la eficiencia de los métodos de purificación. Se estudiaron los casos 1 a 15 sin tratamiento posterior del ADN extraído; y las muestras 16 a 41 con purificación previa. Se obtuvieron los resultados que se detallan en las Tablas XI y XII. Se emplearon métodos de transferencia (Southern blot) y sondeo únicamente a los efectos de confirmar la inclusión de un sospechoso. Por lo tanto, los casos en que se halló ADN de origen masculino pero sin contar con material biológico de los sospechosos, o que éstos resultaron excluídos por PCR, se resolvieron sin utilizar Southern blot (SB). TABLA XI (sin purificación)
Si bien las técnicas implementadas para el análisis de manchas e hisopados resultaron altamente satisfactorias para la separación del ADN correspondiente al material no seminal (sangre, células de descamación, etc.), del ADN proveniente del semen, la mayoría de los casos analizados en una primera etapa (Tabla XI, sin purificación), no permitieron lograr resultados positivos, ni siquiera en los hisopados, que necesariamente deberían contener material celular femenino. Ante la observación de que, en todos los casos, el material llegó a nuestro Laboratorio en condiciones inapropiadas (generalmente húmedo, a veces sumergido en medios de cultivo para bacterias), el resultado negativo fué atribuído a la degradación del ADN presente originalmente en los mencionados hisopados. Considerando que en nuestro país, desde la denuncia de la violación, hasta la obtención de la muestra por parte del médico forense transcurrían varias horas, y aún días, podría explicarse la ausencia de ADN seminal en los casos mencionados. Naturalmente, otras posibilidades serían que no hubiera habido emisión de semen, o que ni siquiera hubiera existido violación. En todas las situaciones en que se observa la presencia aparente de semen, logra extraerse suficiente ADN como para ser evaluados mediante transferencia a soportes sólidos (Southern blot) y PCR. En cambio, la ausencia aparente de semen, no implica la ausencia de resultados. TABLA XII (con purificación)
La Tabla XIII presenta la comparación de los resultados obtenidos en ambas tablas anteriores: TABLA XIII
La Figura 3 representa gráficamente los valores tabulados en la Tabla XIII. FIG. 3 Con el desarrollo de nuevos métodos de purificación de ADN (Tabla XII), el porcentaje de resultados positivos, tanto en cuanto al hallazgo de material femenino como masculino, prácticamente se duplicó, reduciéndose notoriamente el número de muestras a partir de las cuales no se obtuvo material analizable. La implementación de una estrategia de análisis consistente en utilizar los métodos de transferencia y sondeo únicamente en los casos en que el material de origen masculino coincidía con el sospechoso para todos los sistemas de STRs (short tandem repeats), permitió confirmar la inclusión en todos los casos, por lo cual podría concluírse que analizando un gran número de STRs podría prescindirse del Southern blot, mucho más engorroso y lento que la PCR. Otras muestras forenses que involucran fluídos biológicos sobre soportes sólidos. Se seleccionaron diferentes materiales con manchas de fluídos biológicos, a efectos de comparar con los resultados obtenidos a partir de muestras provenientes de donantes (ver punto 4.1.1.2 del presente trabajo). Los materiales se clasificaron previo al análisis en: absorbentes: sobre telas o papel de filtro, parcialmente absorbentes: sobre hojas de cuaderno o de diario, colillas de cigarrillos, piso de cemento, madera sin lustrar, y no absorbentes: sobre metal, látex, plástico, piel.
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