Índice de esta clase:
- Combinación de plásmidos.
-
Fusión de protoplastos.
-
HIbridomas
Es una
técnica más simple que la del ADN recombinante, que consiste en extraer
plásmidos con características interesantes de diferentes células e
incorporarlos, sin modificación, en un sólo microorganismo, que reúne,
entonces, las características de los organismos originales[1].
La célula
vegetal posee alrededor de la membrana citoplásmica un tabique rígido que
puede ser levantado por tratamientos específicos de suerte que dejará a la
célula (somática, llamada protoplasto) “desnuda”. Fusionados los protoplastos
se pueden crear especies nuevas al evitar los inconvenientes del proceso
sexual.
Esta
técnica permite:
 |
crear
híbridos interespecíficos (v.gr., el “pomate”);
|
|
crear
cíbridos, es decir híbridos que dependen de las características del citoplasma
y de los organillos debido a que se elimina el núcleo de una de las células;
|
|
crear
híbridos particulares, luego que una parte de las estructuras genéticas de una
célula son destruidas (v.gr., por irradiación);
|
|
duplicar
el nivel de la ploidía (número de cromosomas).
|
La
búsqueda de métodos para la obtención de plantas transgénicas sin la
intervención de un vector, surgió como respuesta a la incapacidad de
Agrobacterium para transformar plantas monocotiledoneas y el no responder con
la misma capacidad de transformación en cada especie vegetal. Esto obligó a
buscar una solución al dilema que presentaban las plantas económicamente más
importantes al no poder ser transformadas mediante esta vía por ser
monocotiledoneas. La solución fue el desarrollo de una tecnología alternativa,
llamada transferencia de genes directa o sin vectores. En la cual el ADN
transformado es introducido en protoplastos (considerados el sistema ideal
para la transferencia de genes), tejidos, células, plantas por medio de
tratamientos químicos o por fuerza mecánicas o eléctricas.
Finalmente de todas
las técnicas desarrolladas para la transformación de células vegetales, solo
algunas de estas han podido ser utilizadas en la obtención de plantas transgénicas (bombardeo con partículas, microinyección) no obstante a
continuación se hará una breve referencia sobre cada una de estas.
 |
a) Transporte
directo de ADN en protoplastos. Los protoplastos son las
estructuras ideales para la transferencia de genes ya que el ADN tiene libre
acceso a las membranas plasmaticas libres y a todos los receptores libres en
una población, y además cada protoplasto ha pasado por un procedimiento de
aislamiento. Es decir los protoplastos son capaces de captar ADN, sin embargo
esto es estimulado por la presencia policationes (poli L-lisina, poli-L-ornitina);
por iones de Ca++, Mg++ o Zn++; o por un tratamiento con PEG (polietileno
glicol), los cuales actúan como agentes protectores estimulando la
compactación y agregación del ADN.
La aplicación de este método a permitido la
transformación de protoplastos de una amplia variedad de fuentes vegetales, es
decir no posee un rango de hospedero limitado como lo es en el caso de
Agrobacterium el cual solo ha sido efectivo en la transformación de plantas
dicotiledoneas. Desafortunadamente a pesar de las ventajas antes mencionadas,
la regeneración de plantas a partir de protoplastos continua siendo un proceso
delicado ya que solo se han logrado esclarecer las condiciones necesarias para
algunas especies vegetales, siendo estas el maíz, arroz, cebada y trigo.
|
 |
b) Electroporación. Hoy día es la técnica más utilizada para la transformación de protoplastos debido a su eficiencia. Se realiza por medio de la aplicación de
un toque de corriente al protoplasto, el cual temporalmente abre los poros de
sus membranas celulares, permitiendo así la entrada de moléculas de ADN. |
 |
c)
Electroforesis. Si bien la electroforesis representa otra forma de transferir
genes foráneos, Potrykus (1991) explica que ha sido escasamente utilizada
debido a que en los ensayos realizados no se han obtenido pruebas de una
transformación integrativa. De acuerdo a los autores Kahl y Weising (1993), la
transferencia de genes por electroforesis consiste en suspender los
protoplastos o células a utilizar en una microgota entre el ánodo y el cátodo,
siendo el ADN electroforisado a través de las membranas.
Tanto la
electroporación como la electroforesis se basan en la utilización de campos
magnéticos, en lo que se diferencian es en el mecanismo para transferir los
genes a través de la membrana.
|
 |
d)
Bombardeo con partículas. Es una técnica reciente y prometedora. Esta basada
en la introducción de macromoleculas de ADN cubiertas de oro o tungsteno en
células y tejidos intactos por medio de microproyectiles a alta velocidad.
La
utilización de esta técnica ha permitido la transformación de variedades
vegetales de importancia económica como el Sorghum vulgare las cuales son
recalcitrantes a la transformación por medio de Agrobacterium. El empleo de
este método presenta algunas ventajas sobre los demás como ser su facilidad de
manejo, un solo disparo puede transferir genes a muchas células, los genes que
se encuentran biológicamente activos en la macropartícula, este depende
únicamente de parámetros físicos. Logrando así transportar genes a muchas
células cerca de la posición deseada sin que implique un gran esfuerzo manual.
|
 |
e)
Técnica de microondas láser. Consiste en lo siguiente: una microonda de rayos UV-láser es enfocada en la vía lumínica de un microscopio, permitiendo así la
perforación de las paredes y membranas celulares de las células, con lo cual
al conservarlas en un medio plasmolisante, se facilita la toma de ADN foráneo
en las células o cloroplastos. Sin embargo a pesar de que se ha logrado la
transferencia de ADN, esta técnica presenta algunas desventajas frente a otras
técnicas tales como su alto costo y su menor precisión por lo que su uso se ve
limitado.
|
 |
f)
Microinyección. Esta a pesar de haber sido originalmente desarrollada para la
inyección de macromoléculas en células animales, esta siendo también utilizada
para la obtención de plantas transgénicas. Esta técnica permite la inyección
de ADN, en protoplastos y embriones (siendo entonces una solución para los
problemas que se presentan en la transformación de cereales), permitiendo así
obtener, a partir de la primera generación, plantas transgénicas de origen
clonal. Otra ventaja que se pueden considerar al utilizar esta vía es la
posibilidad de que la cantidad de ADN a entregar sea optimizada, asimismo se
puede decidir en cual célula se dejara el ADN es decir su entrega es precisa y
predecible. Este método no obstante el éxito obtenido presenta algunas
desventajas como lo son el que solo una célula recibe ADN por inyección,
además su manejo requiere una mayor pericia e instrumentación.
Para poner
en práctica la microinyección se puede utilizar:
- una
inyección capilar conteniendo el ADN transformado y un soporte en el cual los
protoplastos o células son temporalmente inmovilizados para su inyección.
- una
inyección capilar trabajando conjuntamente con una "capilaridad sostenida", la
que es utilizada para fijar la célula o protoplasto, para una efectiva
inyección de ADN.
|
 |
g)
Macroinyección. En contraste con la microinyección esta utiliza para
transportar el ADN a los tejidos, jeringas de inyección normales con agujas
mucho más anchas que el diámetro de la célula con lo que el ADN debe
transportarse a través de las membranas plasmaticas y paredes celulares de las
células adyacentes al sitio herido provocando una gran perdida de ADN, con lo
que podemos concluir que esta técnica no es muy efectiva en la transferencia
de genes y por consiguiente no muy utilizada.
|
 |
h) Fusión de liposomas. Esta a pesar de ser una técnica establecida para la producción
de plantas transgénicas, no se utiliza mucho debido a que no presenta mayores
ventajas sobre las demás técnicas de transferencia directa de genes. |
 |
i)
Inyección de liposomas. En este procedimiento se combinan la encapsidación
liposómica y la microinyección para tratar de destruir la fusión de liposomas
con la membrana del tonoplasto para una entrega segura del ADN a la célula.
Sin embargo a pesar de que se ha realizado la fusión de células de diferentes
cultivos (maíz, tabaco, arroz y zanahoria), el gen trasladado no se ha
expresado en ninguno de los casos. Por lo que la microinyección directa de ADN
en el núcleo de la célula es preferida ante la inyección liposómica.
|
Los
hibridomas son células híbridas resultantes de la fusión de células extraídas
del bazo de un animal (linfocitos) con células cancerosas inmortales y de
reproducción rápida (mielomas). Esta técnica[2] es utilizada para la producción de anticuerpos[3] mononucleados.
La
respuesta normal en lo que concierne a anticuerpos a cualquier molécula que se
ha introducido natural o artificialmente es compleja (policlonal) y da como
resultado la formación de una mezcla de diferentes anticuerpos contra
cualquiera de los sitios antígenos (pueden formarse anticuerpos contra
azúcares, proteínas o lípidos o combinaciones de ellos). La principal ventaja
de la producción de anticuerpos monoclonales es que la respuesta policlonal
compleja descrita puede separarse en sus componentes individuales. Sin embargo
dado que las células que los albergan sólo viven unos pocos días requiere que
las células manipuladas se tornen en inmortales.
La primera
fase en la producción de anticuerpos monoclonales (o mononucleados) consiste
en preparar el antígeno (seleccionando especificidades individuales mediante
fusión celular), éstos son purificados parcialmente, vgr por disgregación
subcelular, lavado con un disolvente apropiado (elución) de bandas proteínicas
a partir de geles de acrilamida o enriquecimiento cromotográfico.
Posteriormente, se inocula al animal en cuestión con los antígenos
seleccionados, de suerte que cada linfocito produzca un anticuerpo específico;
cada uno de ellos (normalmente mortal) es posteriormente, inmortalizado por la
fusión con un mieloma (célula cancerosa, de reproducción indefinida y rápida).
La célula resultante con una nueva carga genómica, guarda su especificidad en
la producción de anticuerpos homogéneos (y únicos, de allí su denominación de
anticuerpos monoclonales) al originar un clon de nuevas células, con la
rapidez del mieloma.
El
hibridoma productor del anticuerpo monoclonal para poder ser analizado para su
utilización dependiendo de la unión directa del anticuerpo con su antígeno,
la cual no es fácil de detectar, por lo que se le adiciona un segundo
anticuerpo marcado ya sea con una molécula fluorescente, un isótopo
radiactivo, o con una enzima que posee un producto de reacción coloreada; de
esta manera puede detectarse la unión de un anticuerpo monoclonal con su
antígeno, una vez que la cavidad que contiene el anticuerpo deseado es
identificada, las células tienen que clonarse para tener la certeza de que
todas proceden de un sólo producto de fusión (lo que se logra reduciendo, por
dilución, a una las células de cada cavidad para que cuando vuelvan a crecer
los sobrenadantes de esos clones correspondan a un único origen), asegurado lo
cual el producto se congela en nitrógeno líquido para su almacenamiento[4].
Anticuerpos
monoclonales (AM).
|
Los AM fueron
producidos por vez primera por Kholer y Milstein en 1975,
que obtuvieron el Premio Nobel de Medicina en 1984 por tal
descubrimiento. Los mencionados autores consiguieron unir dos
células y obtener un híbrido (Hibridoma) que presentaba
características funcionales de ambas poblaciones celulares. Así,
fusionaron un linfocito B de bazo de un ratón inmunizado
con eritrocitos de oveja que producía anticuerpos contra un
epitope del eritrocito, con células de mieloma de un ratón
que vivía de forma indefinida "in vitro" .Obtuvieron un híbrido
que era capaz de segregar inmunoglobulinas frente al
epitope del eritrocito de oveja de forma permanente, ya que el
hibridoma también había adquirido la capacidad de secreción de
inmunoglobulinas del mieloma y su capacidad para vivir "in vitro".
Es decir, consiguieron producir anticuerpos "in vitro" frente a un
sólo determinante de una compleja estructura antigénica. |
|
ETAPAS DE PRODUCCIÓN DE HIDRIDOMAS:
1.- OBTENCIÓN DEL
ANTÍGENO
2.- INMUNIZACIÓN
3.- FUSIÓN
4.- RESTRICCIÓN DEL CRECIMIENTO A LOS HÍBRIDOS FORMADOS
5.- SELECCIÓN DE LOS HIBRIDOMAS POSITIVOS
6.- CLONAJE Y ESTABILIZACIÓN
7.- CARACTERIZACIÓN
|
|
  
NOTAS:
|
