¿Por qué
esta magnífica tecnología científica, que ahorra trabajo y nos hace la vida
mas fácil, nos aporta tan poca felicidad? La repuesta es está, simplemente:
porque aún no hemos aprendido a usarla con tino.
Albert Einstein
Índice de esta clase:
-
Introducción
-
La
gel-electroforesis
-
Marcadores:
sondas y RFLPs
-
Amplificación
del gen (Southern blot y PCR)
-
Vectores
-
ADN recombinante
-
ADN sintético
-
ARN contrasentido
-
Biochips
La ingeniería genética
persigue la modificación del patrimonio hereditario de un organismo introduciendo (o deleccionando, en su caso) en su haber génico uno o varios
genes pertenecientes a un organismo de una especie distinta. El proceso puede
utilizarse ya en bacterias ya en células eucariotas vegetales o animales (más
adelante se detallarán los pasos a dar en cada caso); una vez adicionada o
modificada la carga cromosomática, el organismo en cuestión sintetiza la
proteína deseada y el aumento del rendimiento de la producción puede obtenerse
mediante el aumento en la población portadora. Las bases de la ingeniería
genética han sido el resolver estos dos problemas: localización e inserción de
genes y multiplicación redituable de las factorías logradas.
Las técnicas utilizadas por
la ingeniería genética son varias y, a continuación, se describirán las más
importantes; cada una atiende un aspecto o paso de la tarea de preparación y
solución de los problemas específicos de esta tecnología, sin embargo muchas
de ellas ha tenido éxito en otros campos tecno-científicos.
El
problema de encontrar, separar y analizar los fragmentos de ADN
correspondiente a un gen específico se logró resolver sobre la base de los
estudios de Linus Pauling que demostraron que las moléculas migran a distintas
velocidades hacia los polos magnéticos: se colocan porciones de ADN sobre un
gel de agarosa o poliacrilamida y se les permite que migren hacia los polos
del campo magnético (siendo que los grupos fosfato del ADN tienen carga
negativa, migrarán hacia el polo positivo; las porciones más pequeñas lo harán
más rápido y más lejos que las grandes). La senda seguida por el ADN y las
manchas formadas se tornan visibles en una película de rayos X como el código
de bandas de un producto en el supermercado.
La gel-electroforesis -nombre de
esta técnica- permite tratar con bajas concentraciones de ADN, de hasta 100
nanogramos (una cienmillonésima de gramo)[1].
El
objetivo de esta técnica es, mediante un método bioquímico, basado en
reacciones enzimáticas poder analizar de forma rápida la variabilidad genética
que se puede encontrar en una población determinada. La practica de la
electroforesis de enzimas en gel aplica una afirmación teórica el producto de
un gen, será un polipéptido, es decir una proteína, que en el caso, tendrá
actividad enzimática.
El método
consiste en obtener las enzimas del material que se desea conocer empaparlas
en papel secante, e introducir estos papeles en el gel, posteriormente habrá
que someterlo a la electroforesis[2] para lograr la migración de las
proteínas que será diferencial dependiendo de la carga
eléctrica de la proteína.
Si dos
proteínas tienen la misma movilidad , será que los alelos son iguales, y en
consecuencia el organismo será homocigoto, por el contrario, a movilidad
desigual, los alelos serán diferentes aceptando en este caso que el individuo
es heterocigoto, lo que se verá será una serie de puntos mas o menos
alineados, en los que dependiendo de estos puntos, se podrá fácilmente
determinar la homocigosis o no de la fuente del material, combinando muchos
individuos, se podrá analizar la variabilidad genética de una determinada
población, también con este método se puede calcular la frecuencia.
Cabe
entonces individualizar cada gen sobre la cadena de ADN en los
cromosomas, identificando su rol en el concierto
genético. Para ello se cuenta con marcadores, esto es segmentos reconocibles
de ADN a lo largo de la cadena que permite estimar la
localización relativa de otros genes[3]. El llamado ligamiento de genes[4], que es aún hoy el usado por
los genetistas involucrados en el Proyecto Genoma Humano, evalúa el índice de
repetición después del crossing over (a menor repetición, mayor distancia
entre el gen buscado y el marcador, y viceversa), este
método que como ya se mencionó fue el usado por A. Sturtevant, en 1913, lleva
a rastrear genes específicos en varias generaciones familiares y depende de la
expresión del gen en cuestión.
Sin
embargo los días del gen marcador, fenotípicamente detectable, han sido
parcialmente superados por el desarrollo de marcadores anónimos:
 la
autorradiografía de las sondas radiactivas de ácidos
nucleicos[5] se logran uniendo un isótopo
radiactivo al fragmento de ADN, consecuentemente la emisión de radiación a ó b
puede imprimir sobre una placa sensible; pero no es el único medio de
marcación de ácidos nucleicos;
la
reacción coloreada lograda a través del uso de biotina y estreptavidina, o
bien digoxigenina y un anticuerpo que la reconoce, la enzima fosfatasa
alcalina marca la sonda dando lugar, con su presencia, a un cambio de color
del reactivo azul de tetrazolio;
la
separación magnética causada cuando la biotina, ayudada por la estreptavidina,
permite ligar una partícula magnética que puede ser separada, junto con la
sonda a la que está adherida, mediante el empleo de un imán;
la
reacción luminosa es provocada por la peroxidasa, unida al ADN en forma
directa o a través de fluoresceina y un anticuerpo, al emplearse el reactivo
luminol, permitiendo la localización de la sonda marcada, por su luminosidad;
la técnica
ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) reconoce epitomes, es decir
configuraciones espaciales de zonas de proteínas o ácidos nucleicos. Está
especialmente indicada cuando se trata de virus o viroides, pues éstos se
encuentran habitualmente asociados a proteínas de las cuales deben ser
separados para permitir que los fragmentos de ácidos nucleicos (la secuencia
usada como sonda y aquella a analizar) puedan unirse. [ver
Gráfico 2]
los RFLPs
(polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción), comúnmente
llamados “rif-lips”: cuando una determinada enzima de restricción es aplicada
sobre el ADN ésta lo “corta” en lugares precisos y conocidos que dan como
resultado sondas de largos específicos[6] (luego, las diferencias en el
tamaño obedecerán a alteraciones en la composición genética y, en muchos
casos, son la evidencia de anormalidades[7]).
Las sondas
representan una herramienta insoslayable de la ingeniería genética para el
diagnóstico de huéspedes en el ADN celular y virósico, y son útiles en la
investigación a fin de determinar con exactitud posiciones nucleótidas durante
la síntesis de oligonucleótidos, en el laboratorio.
Por su
lado, para la amplificación del gen (u obtención de numerosas copias de un
fragmento específico del ADN) los biotecnólogos cuentan con dos procedimientos
que son, hoy, los más usados:
El logrado
por E.M. Southern en 1975 y que lleva su nombre[8], comienza con la separación
del ADN digerido por enzimas de restricción, los fragmentos resultantes se
separan por tamaño mediante la gel-electroforesis y luego se transfieren a un
filtro. El ADN adherido se desnaturaliza (sometiendo las doble cadenas de ADN
a alta temperatura lo que rompe los puentes hidrogenados que las mantienen
unidas) y se lo hibrida (o deja que se ligue) exponiéndolo a sondas radiativas
(fragmentos de ARN o ADN de cadena simple, correspondientes a los nucleótidos
que son parte del gen que se desean estudiar, marcados con un isótopo
radiativo), lo que permitirá, después del lavado del filtro de soporte, para
eliminar el material que no se haya asociado a las sondas, detectar por rayos
X los fragmentos de interés para su purificación y duplicación en
procedimientos de estudios o manipulación.
En 1988
estuvo disponible un nuevo método la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
ideada en 1983 por Kary Mullis. Éste permite la amplificación de genes en
grandes cantidades a partir de muy poco ADN y mecánicamente. El sistema
implica la adición de un cebador corto (un oligonucleótido) en cada extremo de
la secuencia elegida de ADN, separando las dos cadenas de la doble hélice por
calentamiento y exponiéndolas a un ADN polimerasa (enzima que naturalmente
replica y repara del ADN) bacteriano que reconoce a los cebadores dispuestos a
cierta distancia entre sí en lados opuestos de la cadena y duplica el número
de cadenas de ADN en la muestra. Esta enzima (ADNp tac) es obtenido a partir
de una purificación de una bacteria que prospera en las elevadas temperaturas
de las aguas termales y que no se desnaturaliza por temperatura cuando el ADN
seleccionado lo es. De este modo en la PCR, ambas cadenas de ADN se copian
simultáneamente y si el procedimiento se repite unas veinte veces se obtendrán
un millón de copias a partir de un solo fragmento original.
Cuando se
pretende que las “factorías” biotecnológicas (o una célula) produzca un
material específico, debe dársele la orden específica, esto es proveerle de
los genes necesarios. Para ello se debe agregar a su ADN natural un
complemento génico (previamente determinado y aislado), lo que es posible por
medio de un vector o transportador.
los
plásmidos[9] (descritos en el capítulo
anterior) son usados como vectores dada la facilidad con pueden ser “abiertos”
y su corto mensaje natural, características que permiten la adición de genes
extraños y aún entonces su reinserción en sus bacterias de origen donde se
replicarán expresando las instrucciones añadidas;
los lambda[10] y los cósmidos también son
usados como vectores, para lo cual deben ser preparados para poder clonar
secuencias de ADN extraño más largas que los transportables por plásmidos
(éstos, en tanto vectores, deben competir, en clara desventaja, durante su
replicación con los más pequeños no cargados). La preparación del fago lambda
se lleva a cabo mediante la supresión de la zona central de su ADN (allí
residen genes que no son necesarios para infectar la célula, ni para
multiplicarse dentro de ella) por el empleo de enzimas de restricción
específicas para cierto tipo de cepas; en su lugar se inserta el ADN escogido
del mismo largo -aproximadamente de unas 20.000 bases- que el ADN deleccionado.
Cuando las
porciones del ADN extraño son mayores, se apela a los extremos cohesivos de
lambda llamados COS que son sitios de reconocimiento para la enzima que corta
el ADN viral para la síntesis de la cápside, y que están separados por unos
35.000 a 45.000 pares de bases, las que son reemplazadas por el ADN extraño,
una vez en la célula el cósmido se multiplica como un plásmido normal, esto
los hace muy buenos vectores.
El uso de
virus tiene una ventaja adicional:
 no sólo
accede al blanco sino que sus promotores (secuencias génicas iniciadoras del
proceso de trascripción) son fuertes, dando como resultado que los genes se
expresen eficientemente.
otros
vectores (utilizados en estadio experimental) son logrados a partir del
aprovechamiento de la capacidad de ciertos componentes de la sangre o de otros
fluidos corporales de penetrar en las células por interacción con los
“receptores” existentes en la superficie celular, pero puede ocurrir que el
receptor no sea el adecuado para la célula que se intenta penetrar. Por lo que
se ha elaborado un método válido para cualquier célula, éste consiste en
envolver el gen en una vesícula microscópica llamada liposoma, formada por una
membrana artificial semejante a las que rodean las células: cuando la vesícula
entra en contacto con la célula, su membrana se funde con la membrana celular
y el gen que contiene se introduce en la célula.
Así mismo se ha comprobado que el ADN puro puede penetrar
fácilmente en las células, lo que abre el camino para la elaboración de una
técnica aún más sencilla.
Esta
técnica reposa sobre la observación de la recombinación del ADN in-vivo
durante la conjugación y la transformación en el mundo de las bacterias (ver
el capítulo anterior).
Está
regida por tres premisas fundamentales:
 la lectura
precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN (método de Maxam-Gilbert y de
Sanger)[11];
el recorte
del ADN con las enzimas de restricción en los lugares precisos y conocidos (endonucleasas)
y el ligamiento de los restantes fragmentos de ADN con otras enzimas (ligasas);
la
localización de vectores de clonación, es decir de fragmentos de ADN que para
ello, sin perjuicio de lo ya expuesto en el punto anterior, deben poseer dos
propiedades:
debe ser
capaz de replicarse, es decir poseer un origen de replicación compatible con
la especificidad de la célula donde ha sido introducido. De este modo un
vector “vehículo” que puede pasar de una bacteria a una levadura deberá poseer
dos orígenes de replicación diferentes, uno específico de la bacteria y el
otro de la levadura;
debe
poseer un gen que le confiera una propiedad particular a la célula en el que
se encuentra, para poder entonces, separar las células que contienen el vector
de aquellas que no lo contienen, por el empleo de los marcadores, del modo que
ya se hiciera mención.
Las
secuencias de ADN recombinadas pueden ser obtenidas por diferentes medios:
por
síntesis química, esta síntesis es automática y hoy en día puede ser hecha
mecánicamente y controlada por ordenador;
por copia
del ARN mensajero, una enzima llamada transcriptasa inversa, aislada de
ciertos virus (los retrovirus, en los que el genoma está constituido por ARN)
es capaz de copiar bajo la forma de ADN tanto una secuencia de ADN como de
ARN. Puede, a partir de una secuencia de ARN mensajero, formar una cadena de
ADN complementaria. La manera más corriente de clonar este ADN complementario
es hacerlo copiar por un ADN polimerasa o transcriptasa para así obtener un
ADN de doble cadena. Se deberán, además, formar cortes colgantes para
facilitar su inserción posterior por alguno de los tres procedimientos
siguientes:
partiendo
el ADN por una enzima de restricción;
adicionando colas de una serie de desoxinucleótidos idénticos formando una
sola cadena a cada lado del ADN;
adicionando sitios de restricción obtenidos por síntesis orgánica, los
“linkers” serán enseguida digeridos por la enzima de restricción
correspondiente para provocar los cortes colgantes.
La
utilización de secuencias de ADN recombinante ofrece una ventaja ligada a la
estructura compleja de los genes de los organismos superiores. En efecto, las
secuencias correspondientes a los intrones que interrumpen las regiones
codificantes de los genes eucariotas no pueden ser reconocidas y recogidas por
los ARN precursores de las bacterias, y evita la síntesis de proteínas
aberrantes.
Los ARN
mensajeros citoplásmicos de las eucariotas han sufrido ya el empalme y su
copia en ADN complementario podrá ser utilizada como gen por las bacterias.
por
aislamiento de un gen de un cromosoma (técnica de “shot gun”), normalmente de
células de organismos superiores. Para realizarlo, se procede en dos etapas
utilizando herramientas ya descritas en este parágrafo:
 en primer
lugar se construye una “biblioteca” del genoma, se recorta el cromosoma con la
ayuda de una enzima de restricción y se inserta la mezcla de millones de
fragmentos de ADN obtenidos en un número equivalente de vectores (generalmente
bacteriofagos).
luego de
haberse multiplicado (infección de las bacterias por los fagos), esta
población de vectores recombinados se seleccionará el o los fagos que
contienen el gen buscado. A este fin, se cierne la biblioteca genómica a
través de un medio de sondeo molecular del ADN específico del gen, el ADN
complementario de su ARN mensajero o un fragmento de ADN sintético. La sonda
específica marcada por los nucleótidos radiactivos se apareará e hibridará con
la secuencia complementaria presente en el ADN del fago que contiene al gen.
No quedará más que aislar al fago reparado, amplificarlo y preparar al ADN
para estudiar al gen clonado.
La
recombinación genética consiste, entonces, en cortar las cadenas de ADN y a un
plásmido, con la misma enzima de restricción (de suerte que tengan los mismos
trozos colgantes), e insertar un fragmento del ADN en el plásmido, terminando
con la acción de ligamiento. Este plásmido recombinado es insertado en una
población bacteriana, de la cual se seleccionará la bacteria en la que se
introducirá el plásmido (sobre la base de un marcador que él contiene) para
multiplicarlo y así formar un clon de bacterias transformadas. Estas
manipulaciones simples permiten ampliar el número de copias del plásmido hasta
varios miles.
La técnica
que utiliza a un bacteriofago, que posee un genoma lineal, es similar. Como el
genoma del fago tiene un largo máximo y contiene genes inútiles es frecuente
también reemplazar fragmentos de ADN en lugar de insertar un nuevo fragmento,
el que puede estar disponible al cortar al plásmido (extraído de la célula)
con la misma endonucleasa que se utiliza luego de la recombinación.
Este
proceso es conocido también como clonación de un gen, porque permite obtener
grandes cantidades purificadas del gen en cuestión.
La
elección del método y del gen a clonar dependerá evidentemente del fin
perseguido y de la utilización posterior del organismo modificado (vgr,
substancia-producto, producto transformado), y a las posibilidades de
expresión del organismo transformado. En razón de la universalidad del
material genético (la complejidad, pero no el idioma, del genoma varía de una
especie a otra), se puede introducir genes de organismos superiores en una
bacteria, lo que no es posible en la recombinación in-vivo debido a las
barreras genéticas entre las especies, las que sí pueden ser evitada in-vitro.
Los
vectores utilizados son generalmente, como ya se expuso, plásmidos (v.gr., el
pBR 322) que preferiblemente deben ser de talla pequeña y presentar sitios
únicos de restricción fácilmente identificables para la inserción de los
genes, y además, conferir a su célula huésped un trato seleccionado sobre la
base de un gen característico que poseen. Son aislados por la gel-electroforesis
(ver supra) o por ultracentrifugación y eventualmente modificados de acuerdo a
las necesidades. Se utilizan igualmente virus (v.gr., el bacteriofago lambda
-el j 174 descrito en el capítulo anterior-) que deben presentar el mismo tipo
de características en vistas de una manipulación fácilmente realizable.
Finalmente, la célula huésped ideal debe ser fácil de transformar y de
cultivar, debe reproducirse con rapidez, y estar genéticamente bien
caracterizada.
El
microorganismo más utilizado como receptor es la bacteria Escherchia coli, y
también la Bacilus subtilis. Nada empece utilizar otros organismos en los que
el funcionamiento sea bien conocido y para los que existan vectores apropiados
(v.gr., levaduras de células eucariotes).
Se han
desarrollado métodos para sintetizar secuencias cortas de ADN y ARN, en el
laboratorio. Estas moléculas llamadas oligonucleótidos sintéticos constituyen
una fuente de segmentos uniformes de ADN o ARN.
Su
preparación depende de la capacidad de bloquear selectivamente el extremo 3´o
el extremo 5´ de los nucleótidos; esto asegura que las reacciones de
condensación que forman los enlaces azúcar-fosfato ocurran en la secuencia
adecuada para unir los nucleótidos en el orden deseado.
Primero
las moléculas orgánicas que funcionan como grupos de bloqueo se añaden
químicamente a los extremos 3´o 5´ de los mononucleótidos. Estos grupos de
bloqueo actúan impidiendo que se produzca la reacción de condensación en los
extremos “equivocados” de los nucleótidos, pero permiten que ocurra la
reacción deseada: un grupo de bloqueo (específico para un extremo) puede ser
eliminado por un ácido o por tratamiento con una base, en cada caso, la
condensación que se permita en sólo uno de los extremos dará como resultado un
trinucleótido. Estos pasos se repiten una y otra vez hasta que se sintetiza el
oligonucleótido deseado.
Hoy,
resulta posible unir un extremo de la cadena a una bolita de resina (soporte)
en una columna a través de la cual pueden ser pasados secuencialmente los
nucleótidos y los reactivos químicos adecuados, lo que permite automatizar el
procedimiento.
Ya se ha
mencionado la capacidad de las cadenas complementarias de ácido nucleico de
una sola banda para hibridarse específicamente, lo cual se utiliza a menudo en
los procedimientos de clonación. Recientemente se ha advertido que cuando un
ARN complementario de un ARN mensajero particular se sintetiza a partir de ADN
recombinante -que existe en la misma célula- la hibridación resultante de los
dos ARNs impide la traducción del ARNm.
La
producción de dichos ARN contrasentido en plantas y animales implica por lo
común la reintroducción del gen deseado (o parte de él) en tal forma que la
banda de ADN se transcriba produciendo así ARN contrasentido. Esto se logra
normalmente cortando el promotor del gen y colocando un nuevo promotor en el
extremo 3´ del mismo[12].
Una
aplicación consiste en la inyección de secuencias cortas de nucleótidos o
sondas de ácidos nucleicos anti-sentido, obtenidas por síntesis química, que
se unen al ARN nuclear y bloquean su procesamiento o salida desde el núcleo;
otras veces se unen directamente al gen para impedir su transcripción en ARN.
Como es obvio, este tratamiento es el adecuado para situaciones en las que se
trata de bloquear el funcionamiento de un gen cuyo producto resulta nefasto
para el organismo. Según las previsiones iniciales, estamos ante una técnica
enormemente específica, probablemente decisiva para la regulación controlada
de genes específicos, cuyo dominio podría acelerarse gracias al conocimiento
detallado de la secuencia de todos los genes humanos que el PGH terminará
proporcionando.
En octubre
de 1993, la Agencia Nacional Francesa de Investigación sobre el sida aprobó un
ensayo que proponía el empleo de una secuencia antisentido, producida por la
empresa norteamericana Hybridon, para inhibir la replicación del VIH. De la
estrategia antisentido se esperan además importantes aplicaciones en todas
aquellas enfermedades humanas de claro componente genético, incluyendo el
cáncer, las enfermedades cardiovasculares, las inmunes -alergias-, las
autoinmunes y las infecciones virales[13].
Los
últimos avances en biología molecular, especialmente en genética y genómica,
ha llevado a la aparición de numerosas técnicas experimentales. Entre estas
herramientas destacan los biochips, que permiten conocer mutaciones genéticas
en los pacientes. De este modo, la comunidad científica dispondrá del material
adecuado para afrontar el reto que se le plantea tras haberse completado la
primera fase del Proyecto Genoma: estudiar la función de los genes, las
diferencias genéticas individuales y su incidencia en el desarrollo de las
enfermedades.
Estos
biochips son dispositivos miniaturizados en los que se pueden depositar
decenas de miles de sondas de material genético conocido en posiciones
predeterminadas, constituyendo una matriz. En los estudios, se ponen en
contacto los biochips con material genético marcado, obtenido de una muestra
de un paciente o experimento. En ese momento, generan un patrón de señales
particular cuya lectura se realiza con un escáner y posteriormente se
interpretan con un ordenador.
El
fundamento de los biochips se encuentra en el desarrollo y miniaturización de
las técnicas de afinidad que se conocen y han venido empleando desde hace años
como una herramienta común en biología molecular.
El
desarrollo de los primeros ensayos de afinidad con muestras inmovilizadas
sobre soportes sólidos se remonta a los primeros ensayos inmunológicos que se
desarrollaron en los años 60´s y en los que se inmovilizaban sobre una
superficie antígenos o anticuerpos para su detección. El siguiente paso en la
evolución hacia estos dispositivos se dio en los años 70´s cuando Edwin
Southern, comenzó a emplear filtros de nitrocelulosa para que actuasen como
soporte sólido para la adhesión de moléculas de ADN. El ADN así inmovilizado
no interacciona con las otras moléculas inmovilizadas pero mantiene su
capacidad de hibridar con moléculas complementarias en disolución. La
detección de estas hibridaciones se realizaba mediante la detección de un
marcador radiactivo en un revelado por autorradiografía (esta técnica es la
vista como Southern blot, que después se extendió al campo de la
inmovilización de proteínas y ARN)
Con la
puesta a punto de la técnica de Southern, el siguiente paso en el camino hacia
la aparición de los biochips consistió en la construcción de matrices de
material biológico inmovilizado por este mecanismo empleando para ello
superficies porosas como son las membranas de nitrocelulosa o nylon.
Posteriormente se comenzó a trabajar con el empleo de superficies con unos
tamaños de poro más reducidos y con soportes sólidos como pueden ser el vidrio
y el silicio. Paralelamente con la llegada y desarrollo de las técnicas de
miniaturización también se comenzó a disminuir el tamaño de los puntos de
material depositado sobre la superficie, consiguiendo de esta manera una mayor
densidad de integración en las matrices. La aplicación de las técnicas de
miniaturización condujo hasta el desarrollo de las micromatrices.
Uno de los
acontecimientos más importantes se produjo a finales de la década de los 80´s
cuando en un laboratorio de la compañía entonces llamada Affymax, un grupo de
cuatro científicos, Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read y Lubert
Stryer, que trabajaba en la síntesis sobre superficies sólidas de péptidos,
terminó desembocando en la plataforma GeneChip, que ha sido desarrollada por
Affymetrix, una compañía escindida de Affymax en 1993. La importancia de
este paso radica en la gran capacidad de miniaturización alcanzada por este
sistema. Posteriormente al nacimiento de la tecnología desarrollada por
Affymetrix se han ido sucediendo la aparición de nuevas compañías y nuevos
desarrollos que han permitido alcanzar el alto grado de diversidad tecnológica
existente en la actualidad.
  
NOTAS:
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