Regulación jurídica de las biotecnologías
Profesora: Dra. Teodora Zamudio ~
Equipo de docencia e investigación

Editado para l@s alumn@s de la U.B.A.-Derecho

 

 

- 1. Ingeniería genética
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þPresupuestos & Condiciones de contorno

þHipótesis iniciales

1. Bases biológicas

Ud. está en esta Unidad pedagógica

2. Herramientas biotecnológicas

otras Clases de esta Unidad Las biotecnologías, concepto
Técnicas biotecnológicas
- 1. Ingeniería genética
- 2. Fusión de materiales celulares
- 3. Fermentación
- 4. Ingeniería enzimática
Biotecnologías aplicables en MICROORGANISMOS
Biotecnologías aplicables en VEGETALES
- 1. A nivel de planta entera
- 2. A nivel celular
- 3. Aplicaciones: fitotecnologías
Biotecnologías aplicables en ANIMALES SUPERIORES
- 1. Técnicas de identificación forense
- 2. Técnicas de diagnóstico
- 3. Terapias génicas
- 3.1. Clonación y Transferencia nuclear
- 3.2. Células madre: embrionarias y de adulto
- 3.3. Técnicas reproductivas con/sin manipulación genética
- 4. Proyecto Genoma Humano. Perspectiva
- 5. Proyecto Proteoma Humano. Enfoque
Nanotecnología: un "nuevo" uso del ADN
 

3. Biodiversidad

4. Ecología/Alimentación

5. Genoma Humano

6. Economía

7. Análisis ético y bio-ético

¿Por qué esta magnífica tecnología científica, que ahorra trabajo y nos hace la vida mas fácil, nos aporta tan poca felicidad? La repuesta es está, simplemente: porque aún no hemos aprendido a usarla con tino.
Albert Einstein

 

Índice de esta clase:

- Introducción

- La gel-electroforesis

- Marcadores: sondas y RFLPs

- Amplificación del gen (Southern blot y PCR)

- Vectores

- ADN recombinante

- ADN sintético

- ARN contrasentido

- Biochips

 

 

 

 

Introducción

La ingeniería genética persigue la modificación del patrimonio hereditario de un organismo introduciendo (o deleccionando, en su caso) en su haber génico uno o varios genes pertenecientes a un organismo de una especie distinta. El proceso puede utilizarse ya en bacterias ya en células eucariotas vegetales o animales (más adelante se detallarán los pasos a dar en cada caso); una vez adicionada o modificada la carga cromosomática, el organismo en  cuestión sintetiza la proteína deseada y el aumento del rendimiento de la producción puede obtenerse mediante el aumento en la población portadora. Las bases de la ingeniería  genética han sido el resolver estos dos problemas: localización e inserción de genes  y multiplicación redituable de las factorías logradas.

Las técnicas utilizadas por la ingeniería genética son varias y, a continuación, se describirán las más importantes; cada una atiende un aspecto o paso de la tarea de preparación y solución de los problemas específicos de esta tecnología, sin embargo muchas de ellas ha tenido éxito en otros campos tecno-científicos.

La gel-electroforesis.

El problema de encontrar, separar y analizar los fragmentos de ADN correspondiente a un gen específico se logró resolver sobre la base de los estudios de Linus Pauling que demostraron que las moléculas migran a distintas velocidades hacia los polos magnéticos: se colocan porciones de ADN sobre un gel de agarosa o poliacrilamida y se les permite que migren hacia los polos del campo magnético (siendo que los grupos fosfato del ADN tienen carga negativa, migrarán hacia el polo positivo; las porciones más pequeñas lo harán más rápido y más lejos que las grandes). La senda seguida por el ADN y las manchas formadas se tornan visibles en una película de rayos X como el código de bandas de un producto en el supermercado.

Gráfico 1  Esquema de la técnica de electroforesis en gel

Fuente: Depto. de Microbiología de la U. de Salamanca (España).

La gel-electroforesis -nombre de esta técnica- permite tratar con bajas concentraciones de ADN, de hasta 100 nanogramos (una cienmillonésima de gramo)[1].

El objetivo de esta técnica es, mediante un método bioquímico, basado en reacciones enzimáticas poder analizar de forma rápida la variabilidad genética que se puede encontrar en una población determinada. La practica de la electroforesis de enzimas en gel aplica una afirmación teórica el producto de un gen, será un polipéptido, es decir una proteína, que en el caso, tendrá actividad enzimática.

El método consiste en obtener las enzimas del material que se desea conocer empaparlas en papel secante, e introducir estos papeles en el gel, posteriormente habrá que someterlo a la electroforesis[2] para lograr la migración de las proteínas que será diferencial dependiendo de la carga eléctrica de la proteína.

Si dos proteínas tienen la misma movilidad , será que los alelos son iguales, y en consecuencia el organismo será homocigoto, por el contrario, a movilidad desigual, los alelos serán diferentes aceptando en este caso que el individuo es heterocigoto, lo que se verá será una serie de puntos mas o menos alineados, en los que dependiendo de estos puntos, se podrá fácilmente determinar la homocigosis o no de la fuente del material, combinando muchos individuos, se podrá analizar la variabilidad genética de una determinada población, también con este método se puede calcular la frecuencia.

Marcadores: sondas y RFLPs.

Cabe entonces  individualizar cada gen sobre la cadena de ADN en los cromosomas, identificando su rol en el concierto genético. Para ello se cuenta con marcadores, esto es segmentos reconocibles de ADN a lo largo de la cadena que permite estimar la localización relativa de otros genes[3]. El llamado ligamiento de genes[4], que es aún hoy el usado por los genetistas involucrados en el Proyecto Genoma Humano, evalúa el índice de repetición después del crossing over (a menor repetición, mayor distancia  entre el gen buscado y el marcador, y viceversa), este método que como ya se mencionó fue el usado por A. Sturtevant, en 1913, lleva a rastrear genes específicos en varias generaciones familiares y depende de la expresión del gen en cuestión.

Sin embargo los días del gen marcador, fenotípicamente detectable, han sido parcialmente superados por el desarrollo de marcadores anónimos:

Gráfico 2 Técnica de reconocimiento ELISA.

Fuente: Fac. de Cs. Agrarias UNNE (Argentina)

la autorradiografía de las sondas radiactivas de ácidos nucleicos[5] se logran uniendo un isótopo radiactivo al fragmento de ADN, consecuentemente la emisión de radiación a ó b puede imprimir sobre una placa sensible; pero no es el único medio de marcación de ácidos nucleicos;

la reacción coloreada lograda a través del uso de biotina y estreptavidina, o bien digoxigenina y un anticuerpo que la reconoce, la enzima fosfatasa alcalina marca la sonda dando lugar, con su presencia, a un cambio de color del reactivo azul de tetrazolio;

la separación magnética causada cuando la biotina, ayudada por  la estreptavidina, permite ligar una partícula magnética que puede ser separada, junto con la sonda a la que está adherida, mediante el empleo de un imán;

la reacción luminosa es provocada por la peroxidasa, unida al ADN en forma directa o a través de fluoresceina y un anticuerpo, al emplearse el reactivo luminol, permitiendo la localización de la sonda marcada, por su luminosidad;

la técnica ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) reconoce epitomes, es decir configuraciones espaciales de zonas de proteínas o ácidos nucleicos. Está especialmente indicada cuando se trata de virus o viroides, pues éstos se encuentran habitualmente asociados a proteínas de las cuales deben ser separados para permitir que los fragmentos de ácidos nucleicos (la secuencia usada como sonda y aquella a analizar) puedan unirse. [ver Gráfico 2]

los RFLPs (polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción), comúnmente llamados “rif-lips”: cuando una determinada enzima de restricción es aplicada sobre el ADN ésta lo “corta” en lugares precisos y conocidos que dan como resultado sondas de largos específicos[6] (luego, las diferencias en el tamaño obedecerán a alteraciones en la composición genética y, en muchos casos, son la evidencia de anormalidades[7]).

Las sondas representan una herramienta insoslayable de la ingeniería genética para el diagnóstico de huéspedes en el ADN celular y virósico, y son útiles en la investigación a fin de determinar con exactitud posiciones nucleótidas durante la síntesis de oligonucleótidos, en el laboratorio.

Amplificación del gen (Southern blot y PCR).

Por su lado, para la amplificación del gen (u obtención de numerosas copias de un fragmento específico del ADN) los biotecnólogos cuentan con dos procedimientos que son, hoy, los más usados:

El logrado por E.M. Southern en 1975 y que lleva su nombre[8], comienza con la separación del ADN digerido por enzimas de restricción, los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante la gel-electroforesis y luego se transfieren a un filtro. El ADN adherido se desnaturaliza (sometiendo las doble cadenas de ADN a alta temperatura lo que rompe los puentes hidrogenados que las mantienen unidas) y se lo hibrida (o deja que se ligue) exponiéndolo a sondas radiativas (fragmentos de ARN o ADN de cadena simple, correspondientes a los nucleótidos que son parte del gen que se desean estudiar,  marcados con un isótopo radiativo), lo que permitirá, después del lavado del filtro de soporte, para eliminar el material que no se haya asociado a las sondas, detectar por rayos X los fragmentos de interés para su purificación y duplicación en procedimientos de estudios o manipulación.

En 1988 estuvo disponible un nuevo método la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ideada en 1983 por Kary Mullis. Éste permite la amplificación de genes en grandes cantidades a partir de muy poco ADN y mecánicamente. El sistema implica la adición de un cebador corto (un oligonucleótido) en cada extremo de la secuencia elegida de ADN, separando las dos cadenas de la doble hélice por calentamiento y exponiéndolas a un ADN polimerasa (enzima que naturalmente replica y repara del ADN) bacteriano que reconoce a los cebadores dispuestos a cierta distancia entre sí en lados opuestos de la cadena y duplica el número de cadenas de ADN en la muestra. Esta enzima (ADNp tac) es obtenido a partir de una purificación de una bacteria que prospera en las elevadas temperaturas de las aguas termales y que no se desnaturaliza por temperatura cuando el ADN seleccionado lo es. De este modo en la PCR, ambas cadenas de ADN se copian simultáneamente y si el procedimiento se repite unas veinte veces se obtendrán un millón de copias a partir de un solo fragmento original.

 

Vectores.

Cuando se pretende que las “factorías” biotecnológicas (o una célula) produzca un material específico, debe dársele la orden específica, esto es proveerle de los genes necesarios. Para ello se debe agregar a su ADN natural un complemento génico (previamente determinado y aislado), lo que es posible por medio de un vector o transportador.

los plásmidos[9] (descritos en el capítulo anterior) son usados como vectores dada la facilidad con pueden ser “abiertos” y su corto mensaje natural, características que permiten la adición de genes extraños y aún entonces su reinserción en sus bacterias de origen donde se replicarán expresando las instrucciones añadidas;

los lambda[10] y los cósmidos también son usados como vectores, para lo cual deben ser preparados para poder clonar secuencias de ADN extraño más largas que los transportables por plásmidos (éstos, en tanto vectores, deben competir, en clara desventaja, durante su replicación con los más pequeños no cargados). La preparación del fago lambda se lleva a cabo mediante la supresión de la zona central de su ADN (allí residen genes que no son necesarios para infectar la célula, ni para multiplicarse dentro de ella) por el empleo de enzimas de restricción específicas para cierto tipo de cepas; en su lugar se inserta el ADN escogido del mismo largo -aproximadamente de unas 20.000 bases- que el ADN deleccionado.

Gráfico 4 Preparación de un vector  lamba.

Fuente: Dto. de Microbiología y Genética de la U. de Salamanca (España)

Cuando las porciones del ADN extraño son mayores, se apela a los extremos cohesivos de lambda llamados COS que son sitios de reconocimiento para la enzima que corta el ADN viral para la síntesis de la cápside, y que están separados por unos 35.000 a 45.000 pares de bases, las que son reemplazadas por el ADN extraño, una vez en la célula el cósmido se multiplica como un plásmido normal, esto los hace muy buenos vectores.

Gráfico 5 Preparación de un cósmido.

Fuente: Dto. de Microbiología y Genética de la U. de Salamanca (España)

El uso de virus tiene una ventaja adicional:

no sólo accede al blanco sino que sus promotores (secuencias génicas iniciadoras del proceso de trascripción) son fuertes, dando como resultado que los genes se expresen eficientemente.

otros vectores (utilizados en estadio experimental) son logrados a partir del aprovechamiento de la capacidad de ciertos componentes de la sangre o de otros fluidos corporales de penetrar en las células por interacción con los “receptores” existentes en la superficie celular, pero puede ocurrir que el receptor no sea el adecuado para la célula que se intenta penetrar. Por lo que se ha elaborado un método válido para cualquier célula, éste consiste en envolver el gen en una vesícula microscópica llamada liposoma, formada por una membrana artificial semejante a las que rodean las células: cuando la vesícula entra en contacto con la célula, su membrana se funde con la membrana celular y el gen que contiene se introduce en la célula.

Así mismo se ha comprobado que el ADN puro puede penetrar fácilmente en las células, lo que abre el camino para la elaboración de una técnica aún más sencilla.

ADN recombinante.

Esta técnica reposa sobre la observación de la recombinación del ADN in-vivo durante la conjugación y la  transformación en el mundo de las bacterias (ver el capítulo anterior).

Está regida por tres premisas fundamentales:

la lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN (método de Maxam-Gilbert y de Sanger)[11];

el recorte del ADN con las enzimas de restricción en los lugares precisos y conocidos (endonucleasas) y el ligamiento de los restantes fragmentos de ADN con otras enzimas (ligasas);

Gráfico 6 Corte de ADN mediante enzimas de restricción.

Fuente: Depto. de Microbiología de la U. de Salamanca (España).


la localización de vectores de clonación, es decir de fragmentos de ADN que para ello, sin perjuicio de lo ya expuesto en el punto anterior, deben poseer dos propiedades:

debe ser capaz de replicarse, es decir poseer un origen de replicación compatible con la especificidad de la célula donde ha sido introducido. De este modo un vector “vehículo” que puede pasar de una bacteria a una levadura deberá poseer dos orígenes de replicación diferentes, uno específico de la bacteria y el otro de la levadura;

debe poseer un gen que le confiera una propiedad particular a la célula en el que se encuentra, para poder entonces, separar las células que contienen el vector de aquellas que no lo contienen, por el empleo de los marcadores, del modo que ya se hiciera mención.

Las secuencias de ADN recombinadas pueden ser obtenidas por diferentes medios:

por síntesis química, esta síntesis es automática y hoy en día puede ser hecha mecánicamente y controlada por ordenador;

por copia del ARN mensajero, una enzima llamada transcriptasa inversa, aislada de ciertos virus (los retrovirus, en los que el genoma está constituido por ARN) es capaz de copiar bajo la forma de ADN tanto una secuencia de ADN como de ARN. Puede, a partir de una secuencia de ARN mensajero, formar una cadena de ADN complementaria. La manera más corriente de clonar este ADN complementario es hacerlo copiar por un ADN polimerasa o transcriptasa para así obtener un ADN de doble cadena. Se deberán, además, formar cortes colgantes para facilitar su inserción posterior por alguno de los tres procedimientos siguientes:

partiendo el ADN por una enzima de restricción;

Gráfico 7  Secuencias de obtención de ADN recombinante

Fuente: Depto. de Microbiología de la U. de Salamanca (España).

adicionando colas de una serie de desoxinucleótidos idénticos formando una sola cadena a cada lado del ADN;

adicionando sitios de restricción obtenidos por síntesis orgánica, los “linkers” serán enseguida digeridos por la enzima de restricción correspondiente para provocar los cortes colgantes.

La utilización de secuencias de ADN recombinante ofrece una ventaja ligada a la estructura compleja de los genes de los organismos superiores. En efecto, las secuencias correspondientes a los intrones que interrumpen las regiones codificantes de los genes eucariotas no pueden ser reconocidas y recogidas por los ARN precursores de las bacterias, y evita la síntesis de proteínas aberrantes.

Los ARN mensajeros citoplásmicos de las eucariotas han sufrido ya el empalme y su copia en ADN complementario podrá ser utilizada como gen por las bacterias.

por aislamiento de un gen de un cromosoma (técnica de “shot gun”), normalmente de células de organismos superiores. Para realizarlo, se procede en dos etapas utilizando herramientas ya descritas en este parágrafo:

en primer lugar se construye una “biblioteca” del genoma, se recorta el cromosoma con la ayuda de una enzima de restricción y se inserta la mezcla de millones de fragmentos de ADN obtenidos en un número equivalente de vectores (generalmente bacteriofagos). 

luego de haberse multiplicado (infección de las bacterias por los fagos), esta población de vectores recombinados se seleccionará el o los fagos que contienen el gen buscado.  A este fin, se cierne la biblioteca genómica a través de un medio de sondeo molecular del ADN específico del gen, el ADN complementario de su ARN mensajero o un fragmento de ADN sintético. La sonda específica marcada por los nucleótidos radiactivos se apareará e hibridará con la secuencia complementaria presente en el ADN del fago que contiene al gen. No quedará más que aislar al fago reparado, amplificarlo y preparar al ADN para estudiar al gen clonado.

La recombinación genética consiste, entonces, en cortar las cadenas de ADN y a un plásmido, con la misma enzima de restricción (de suerte que tengan los mismos trozos colgantes), e insertar un fragmento del ADN en el plásmido, terminando con la acción de ligamiento. Este plásmido recombinado es insertado en una población bacteriana, de la cual se seleccionará la bacteria en la que se introducirá el plásmido (sobre la base de un marcador que él contiene) para multiplicarlo y así formar un clon de bacterias transformadas. Estas manipulaciones simples permiten ampliar el número de copias del plásmido hasta varios miles.

La técnica que utiliza a un bacteriofago, que posee un genoma lineal, es similar. Como el genoma del fago tiene un largo máximo y contiene genes inútiles es frecuente también reemplazar fragmentos de ADN en lugar de insertar un nuevo fragmento, el que puede estar disponible al cortar al plásmido (extraído de la célula) con la misma endonucleasa que se utiliza luego de la recombinación.

Este proceso es conocido también como clonación de un gen, porque permite obtener grandes cantidades purificadas del gen en cuestión.

La elección del método y del gen a clonar dependerá evidentemente del fin perseguido y de la utilización posterior del organismo modificado (vgr, substancia-producto, producto transformado), y a las posibilidades de expresión del organismo transformado. En razón de la universalidad del material genético (la complejidad, pero no el idioma, del genoma varía de una especie a otra), se puede introducir genes de organismos superiores en una bacteria, lo que no es posible en la recombinación in-vivo debido a las barreras genéticas entre las especies, las que sí pueden ser evitada in-vitro.

Gráfico 8  Detección de plásmidos recombinantes  Gráfico 9 Plásmido pBR322

 

Los vectores utilizados son generalmente, como ya se expuso, plásmidos (v.gr., el pBR 322) que preferiblemente deben ser de talla pequeña y presentar sitios únicos de restricción fácilmente identificables para la inserción de los genes, y además, conferir a su célula huésped un trato seleccionado sobre la base de un gen característico que poseen. Son aislados por la gel-electroforesis (ver supra) o por ultracentrifugación y eventualmente modificados de acuerdo a las necesidades. Se utilizan igualmente virus (v.gr., el bacteriofago lambda -el j 174 descrito en el capítulo anterior-) que deben presentar el mismo tipo de características en vistas de una manipulación fácilmente realizable. Finalmente, la célula huésped ideal debe ser fácil de transformar y de cultivar, debe reproducirse con rapidez, y estar genéticamente bien caracterizada.

El microorganismo más utilizado como receptor es la bacteria Escherchia coli, y también la Bacilus subtilis. Nada empece utilizar otros organismos en los que el funcionamiento sea bien conocido y para los que existan vectores apropiados (v.gr., levaduras de células eucariotes).

 

ADN sintético.

Se han desarrollado métodos para sintetizar secuencias cortas de ADN y ARN, en el laboratorio. Estas moléculas llamadas oligonucleótidos sintéticos constituyen una fuente de segmentos uniformes de ADN o ARN.

Su preparación depende de la capacidad de bloquear selectivamente el extremo 3´o el extremo 5´ de los nucleótidos; esto asegura que las reacciones de condensación que forman los enlaces azúcar-fosfato ocurran en la secuencia adecuada para unir los nucleótidos en el orden deseado.

Primero las moléculas orgánicas que funcionan como grupos de bloqueo se añaden químicamente a los extremos 3´o 5´ de los  mononucleótidos. Estos grupos  de bloqueo actúan impidiendo que se produzca la reacción de condensación en los extremos “equivocados” de los nucleótidos, pero permiten que ocurra la reacción deseada: un grupo de bloqueo (específico para un extremo) puede ser eliminado por un ácido o por tratamiento con una base, en cada caso, la condensación que se permita en sólo uno de los extremos dará como resultado un trinucleótido. Estos pasos se repiten una y otra vez hasta que se sintetiza el oligonucleótido deseado.

Hoy, resulta posible unir un extremo de la cadena a una bolita de resina (soporte) en una columna a través de la cual pueden ser pasados secuencialmente los nucleótidos y los reactivos químicos adecuados, lo que permite automatizar el procedimiento.

 

ARN contrasentido.

Ya se ha mencionado la capacidad de las cadenas complementarias de ácido nucleico de una sola banda para hibridarse específicamente, lo cual se utiliza a menudo en los procedimientos de clonación. Recientemente se ha advertido que cuando un ARN complementario de un ARN mensajero particular se sintetiza a partir de ADN recombinante -que existe en la misma célula- la hibridación resultante de los dos ARNs impide la traducción del ARNm.

La producción de dichos ARN contrasentido en plantas y animales implica por lo común la reintroducción del gen deseado (o parte de él) en tal forma que la banda de ADN se transcriba produciendo así ARN contrasentido. Esto se logra normalmente cortando el promotor del gen y colocando un nuevo promotor en el extremo 3´ del mismo[12].

Una aplicación consiste en la inyección de secuencias cortas de nucleótidos o sondas de ácidos nucleicos anti-sentido, obtenidas por síntesis química, que se unen al ARN nuclear y bloquean su procesamiento o salida desde el núcleo; otras veces se unen directamente al gen para impedir su transcripción en ARN. Como es obvio, este tratamiento es el adecuado para situaciones en las que se trata de bloquear el funcionamiento de un gen cuyo producto resulta nefasto para el organismo. Según las previsiones iniciales, estamos ante una técnica enormemente específica, probablemente decisiva para la regulación controlada de genes específicos, cuyo dominio podría acelerarse gracias al conocimiento detallado de la secuencia de todos los genes humanos que el PGH terminará proporcionando.

En octubre de 1993, la Agencia Nacional Francesa de Investigación sobre el sida aprobó un ensayo que proponía el empleo de una secuencia antisentido, producida por la empresa norteamericana Hybridon, para inhibir la replicación del VIH. De la estrategia antisentido se esperan además importantes aplicaciones en todas aquellas enfermedades humanas de claro componente genético, incluyendo el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, las inmunes -alergias-, las autoinmunes y las infecciones virales[13].

 

Biochips

Los últimos avances en biología molecular, especialmente en genética y genómica, ha llevado a la aparición de numerosas técnicas experimentales. Entre estas herramientas destacan los biochips, que permiten conocer mutaciones genéticas en los pacientes. De este modo, la comunidad científica dispondrá del material adecuado para afrontar el reto que se le plantea tras haberse completado la primera fase del Proyecto Genoma: estudiar la función de los genes, las diferencias genéticas individuales y su incidencia en el desarrollo de las enfermedades.

Gráfico 12 Funcionamiento de un Biochip.

Estos biochips son dispositivos miniaturizados en los que se pueden depositar decenas de miles de sondas de material genético conocido en posiciones predeterminadas, constituyendo una matriz. En los estudios, se ponen en contacto los biochips con material genético marcado, obtenido de una muestra de un paciente o experimento. En ese momento, generan un patrón de señales particular cuya lectura se realiza con un escáner y posteriormente se interpretan con un ordenador.

El fundamento de los biochips se encuentra en el desarrollo y miniaturización de las técnicas de afinidad que se conocen y han venido empleando desde hace años como una herramienta común en biología molecular.

El desarrollo de los primeros ensayos de afinidad con muestras inmovilizadas sobre soportes sólidos se remonta a los primeros ensayos inmunológicos que se desarrollaron en los años 60´s y en los que se inmovilizaban sobre una superficie antígenos o anticuerpos para su detección. El siguiente paso en la evolución hacia estos dispositivos se dio en los años 70´s cuando Edwin Southern, comenzó a emplear filtros de nitrocelulosa para que actuasen como soporte sólido para la adhesión de moléculas de ADN. El ADN así inmovilizado no interacciona con las otras moléculas inmovilizadas pero  mantiene su capacidad de hibridar con moléculas complementarias en disolución. La detección de estas hibridaciones se realizaba mediante la detección de un marcador radiactivo en un revelado por autorradiografía (esta técnica es la vista como Southern  blot, que después se extendió al campo de la inmovilización de proteínas y ARN)

Con la puesta a punto de la técnica de Southern, el siguiente paso en el camino hacia la aparición de los biochips consistió en la construcción de matrices de material biológico inmovilizado por este mecanismo empleando para ello superficies porosas como son las membranas de nitrocelulosa o nylon.

Posteriormente se comenzó a trabajar con el empleo de superficies con unos tamaños de poro más reducidos y con soportes sólidos como pueden ser el vidrio y el silicio. Paralelamente con la llegada y desarrollo de las técnicas de miniaturización también se comenzó a disminuir el tamaño de los puntos de material depositado sobre la superficie, consiguiendo de esta manera una mayor densidad de integración en las matrices. La aplicación de las técnicas de miniaturización condujo hasta el desarrollo de las micromatrices.

Uno de los acontecimientos más importantes se produjo a finales de la década de los 80´s cuando en un laboratorio de la compañía entonces llamada Affymax, un grupo de cuatro científicos, Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read y Lubert Stryer, que trabajaba en la síntesis sobre superficies sólidas de péptidos, terminó desembocando en la plataforma GeneChip, que ha sido desarrollada por Affymetrix, una compañía escindida  de Affymax en 1993.  La importancia de este paso radica en la gran capacidad de miniaturización alcanzada por  este sistema. Posteriormente al nacimiento de la tecnología desarrollada por Affymetrix se han ido sucediendo la aparición de nuevas compañías y nuevos desarrollos que han permitido alcanzar el alto grado de diversidad tecnológica existente en la actualidad.

 

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NOTAS:

[1] Gracias al invento hecho por Ch. Cantor y D.C. Schwartz en 1984 de la gel-eletroforesis de campo pulsante (PFGE), que permite la electroforesis de grandes porciones de ADN (de hasta 10 millones de bases) se pudieron cartografiar el gen de la fibrosis quística (1989) y el del tumor de Wilms (1990). Hoy a la PFGE se le ha unido el control asistido por ordenador.

[2] Se hace con un método discontinuo, utilizando LiOH/Borato 0,02 M. PH 8.1, como tampón de electrodos, Tris/Citratos 0.05M pH 8.3, en lo que se refiere a tampón de gel. cristal en la parte superior y realizar el proceso en frío. Respecto a la las características eléctricas se realiza a 250 V y a 25 mA, una vez establecidas las conexiones y en frío, comienzan a migrar los proteínas.

[3] Las distancias entre los genes en un mapa genético humano típico son grandes: 10 millones de pares de bases (5 % del cromosoma), promedio. Se estima que sólo un muy bajo porcentaje del ADN nuclear codifica para proteínas.

[4] La evidencia de que dos genes cercanos tienden a permanecer juntos, se recuerda, se puso de manifiesto en los estudios sobre la Drosophila melanogaster (o “mosca de la fruta”), en la que los alelos para los ojos púrpura y las alas vestigiales se heredaban juntos.

[5] Las sondas de ácido nucleico se utilizan habitualmente siguiendo un procedimiento que consiste en: a) extracción de ácidos nucleicos de una suspensión celular; b) separación por digestión con enzimas adecuadas y electroforesis en gel de agarosa; c) transferencia (blotting) a una membrana de soporte de nitrocelulosa o nylon y d) hibridación sobre membrana con la sonda marcada.

[6] Las enzimas de restricción  fueron descubiertas en los años ´70 en varias especies bacterianas y cumplen la función, en la naturaleza y para las modernas biotecnologías, de cortar ADN extraño, no al azar sino en un lugar preciso que varía entre cuatro y ocho pares de bases (secuencias conocidas como consecuencias de reconocimiento), asimismo, según el modo de escisión de la doble cadena de ADN sobre la que actúan, pueden dejar extremos colgantes (de cadena simple) que tienden a asociarse nuevamente con nucleótidos complementarios, por lo que se les llama extremos pegajosos. Hoy, se llevan aisladas más de doscientas enzimas de restricción para más de noventa sitios o secuencias de reconocimiento, dando como resultado otros tantos ADN genómicos (ADNg) uniformes y empalmables, de una gran diversidad de fuentes. Generalmente, las enzimas de restricción se obtienen de bacterias, como las: Bam HI (a partir del Bacillus amyloliquefaciens); Eco RI (de la Escherichia coli RY13); Hind III (de la Haemophylus influenzæ Rd); Hpa I (de la Hemophylus parainfluenzæ). Las bacterias también poseen enzimas metiladoras que añaden un grupo metilo (-CH) a uno o más nucleótidos de las cadenas de reconocimiento de su ADN y evitan así el corte de la enzima de restricción.

[7] Al aplicar la enzima de restricción HpaI al ADN humano se producen tres fragmentos posibles que contienen el gen para la cadena b de la hemoglobina; en personas con el alelo normal para globina b la sonda tendrá unos 7.000 a 7.600 nucleótidos; entre la población negra de los EE UU esta sonda llegará a los 13.000 nucleótidos debido a la falta de una secuencia de reconocimiento para la enzima HpaI, indicando el padecimiento de la anemia drepanocítica; y entre los individuos de raza negra de África Oriental o provenientes de ella, esta enfermedad está asociada con fragmentos de 7.600 nucleótidos.

[8] “Southern blott”, del que existen dos variantes Nothern blott y Western blott, que no se corresponden con el nombre de ningún investigador, en esos casos.

[9] Fueron descubiertos como excelentes vectores por Stanley Cohen en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. , quien aisló un pequeño plásmido de la Escherichia coli -el pSC101- que hace a la bacteria resistente a la tetraciclina con sólo una secuencia (GAATTC) escindible por la enzima Eco RI, le adhirió un gen extraño y a pesar de ello el plásmido fue captado por la bacteria, la que no perdió su resistencia a la tetraciclina, se replicó y permitió su recolección posterior dado que su tamaño era mayor que el de los plásmidos no alterados.

[10] Como ya fue considerado en el capítulo anterior los virus pueden tener estadios lisogénicos (durante los cuales llevan a cabo su ciclo lítico) y estadios de latencia (durante los cuales establecen largos períodos de relación con su célula hospedadora) en los que son conocidos como bacteriofagos atenuados: los ADNs viral y bacteriano se han unido y se replican juntos (virus profago), separándose una vez cada 10.000 divisiones celulares para iniciar un nuevo ciclo lítico. Lambda es un bacteriofago como los recién descriptos, que se integra a la Escherichia coli porque el cromosoma de esta última tiene una secuencia corta idéntica a una del lambda.

[11] Desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert, el método usa técnicas de marcación radiactiva y electroforesis: se marca un extremo de las copias múltiples de los fragmentos de cadena sencilla quitando un fosfato y sustituyéndolo por un fosfato radiactivo. La mezcla de moléculas tratadas se divide en cuatro porciones y cada una es tratada químicamente de modo que una base nitrogenada (y sólo esa) sea dañada al azar y la molécula se corte en ese lugar. La electroforesis separará los fragmentos sobre la base de su longitud y las posiciones de las marcas radiactivas pueden ser usadas para conocer la cantidad de nucleótidos que contiene cada fragmento. Esta acción se repite para las cuatro bases (A, T, C y G), siempre en una porción distinta, dando una escalera de secuencias en la que el orden de nucleótidos puede leerse directamente. La variante introducida por la dupla Gilbert-Sanger fue la utilización de procedimientos enzimáticos en lugar de químicos y fue usado por primera vez para establecer la secuencia nucleótica del bacteriofago j 174 -lo que les valió el premio Nobel en 1980-.

[12] Utilizando este principio, se ha conferido a plantas de tabaco “inmunidad” parcial contra el ataque por virus transformándolas con un plásmido que produce ARN antiviral. Otro ejemplo, quizás más llamativa resulta la obtención de flores de Petunia de una gran variedad de colores.

[13] Sin embargo, los primeros resultados indican que la técnica debe afrontar todavía numerosos imprevistos y lo mejor que se puede decir es que los compuestos antisentido no funcionan tal y como los investigadores esperaban. Las impresiones de uno de los investigadores directamente implicados en el diseño de este tipo de oligonucleótidos son ilustrativas: "The assumption is that we are designing oligonucleotides that don´t interact with anything besides [their targets]"; "Many people are worried that a lot of the positive effects reported are not just antisense but other nonantisense mechanisms as well" (Cy Stein, Columbia Univ.).