En este nivel se puede observar que los mecanismos de reproducción y selección pueden ser perturbados por una serie de factores que actúan al mismo tiempo como límites a las posibilidades del sistema.

Estos factores limitantes pueden ser:

a) Inherentes al modo de reproducción;

por impedimento de la fecundación, debido a la existencia de barreras varietales, de incompatibilidad polínica, y otros.

por aborto del embrión. Entre otros, en el caso de especies semejantes o de variaciones en los grados de ploidía, se puede llegar a la fecundación pero sobreviene luego el aborto sistemático de los embriones.

por degeneración de la plántula. En este caso, el embrión evoluciona hasta la madurez, pero la planta que nacerá puede tener anomalías fenotípicas.

por la no formación de órganos reproductores activos.  Una planta normal puede, al momento del desarrollo de sus órganos reproductores, no estar lista para asegurar una evolución completa de los mismos, sea en el ámbito masculino (estéril), o bien en el ámbito femenino, o por ambos.

 b) Inherentes a la técnica de selección;

por imposibilidad de crear una línea parental. El mantenimiento de un genotipo no es posible si la reproducción por la que debe pasar es del tipo alógama estricta o si se trata de un genotipo estéril que no posee el sistema de conservación genética.

por ineficacia del sistema de pruebas. Si la planta es muy sensible a las condiciones en las que ella se desarrolla, es difícil de determinar, para esta planta, el rol desempeñado por el genotipo y por el medio ambiente, respectivamente, en la expresión fenotípica.

Las técnicas de cultivos in-vitro pueden, en la mayoría de los casos, aportar soluciones que permitan levantar estas barreras o límites.

El interés particular de los cultivos de células vegetales y de tejidos vegetales deriva y depende de su carácter totipotente, el que permite la regeneración del material vegetal entero a partir de un “callo” (es decir, de un montón de células indiferenciadas en estado de proliferación intensa), según dos métodos:

La embriogénesis: formación de embriones somáticos de estructura y desarrollo idéntico al del embrión de la semilla;

La organogénesis: obtención de retoños (y luego de plantas) por la producción de tejidos de hojas y de raíz.

Esta regeneración, como todas las técnicas de cultivo in-vitro, exige técnicas apropiadas y específicas.

 

Reseñadas la características de intervención en este ámbito comencemos con una breve exposición de las técnicas:

Índice de esta clase:

Técnicas de reproducción sin manipulación genética.

Técnicas específicas de manipulación genética.

 Transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens.

 Vectores virales y agro infección.

 Transferencia directa de genes.

 Protoplastos y transferencia directa de genes.

 Fusión de liposomas con tejidos y protoplastos.

 Disparo de partículas o Biolística.

 Microinyección.

 Fibras de carburo de silicona.

 Incubación de ADN en tejidos o células.

 Incubación de ADN en semillas y embriones desecados.

 Transformación del polen.

 La ruta del tubo polínico.

 Micro láser.

 Electroforesis en tejidos.

 Sonicación.

 

 

Técnicas de reproducción sin manipulación genética.

Clonación in-vitro. Se trata de una multiplicación vegetativa (asexuada) en número infinito. La disponibilidad de un gran número de ejemplares del individuo a testear, permite acelerar el proceso de selección y optimizar las pruebas de comportamiento en diversas condiciones externas para así verificar sus efectos sobre el fenotipo, además de mantener integra la línea parental verificando la ausencia de cruzamientos y de híbridos, y lograr una producción importante y continua con fines comerciales.

Fertilización in-vitro. Ella permite evitar los inconvenientes que tiene la fecundación en su medio natural y asegura, por ende, la unión de los gametos.

Cultivo de embriones. Esta técnica es utilizada si existe un límite natural  para el desarrollo del embrión.

Este límite puede consistir en:

el tiempo necesario para la maduración de la semilla: se evitan fenómenos de inhibición o de dominación colocando el embrión en cultivo y forzándolo a desarrollarse directamente en una plántula normal;

el aborto sistemático del embrión en formación: este caso se presenta debido a que especies semejantes son capaces de fecundar pero el embrión no es viable.

Cultivo de anteras y de óvulos. El cultivo de células reproductoras masculinas o femeninas permite obtener en el momento adecuado la fijación de las características genéticas que no pueden ser alcanzadas en el ámbito de las plantas más que por un trabajo de autofecundación y de selección de las características deseadas estables durante varios ciclos de reproducción.  Estas células no contendrán más que un juego de cromosomas, y si intentamos doblarlo (natural o artificialmente), la plántula formada poseerá en estas células los dos constituyentes afectados a la expresión de un carácter, pero en estado idéntico (di-haploide), de suerte que el conjunto de caracteres (y no sólo algunos) queden perfectamente fijados.

Polipoidía. Se logra en ciertas partes de una planta, en condiciones particulares (v.gr., cultivos in-vitro) o luego de un tratamiento con alcaloides que, luego de la división celular, los cromosomas ya doblados permanecerán en el mismo núcleo que poseerá entonces el doble de cromosomas (tetraploidía). Diferentes grados de poliploidía  pueden ser obtenidos, lo que permite modificar el tamaño de las células, su tenor en agua, su número de ramificaciones y la conservación del vigor híbrido durante el transcurso de las multiplicaciones.

Técnicas específicas de manipulación genética.

La aplicación de las técnicas de ingeniería genética trasciende los conceptos de la mejora genética tradicional al no limitarse a introducir o manipular caracteres de valor agronómico, tales como el control de insectos, malas hierbas, y enfermedades de las plantas, o la calidad de los productos agrícolas. Debido a su capacidad para crear combinaciones genéticas totalmente nuevas y de manipular y dirigir su expresión temporal y espacial, la ingeniería genética permite desarrollar plantas transgénicas cuyos productos pueden tener interés para las industrias agroalimentarias, químicas y farmacéuticas. El uso agrícola de germoplasma recombinante de elite, capaz de producir compuestos de alto valor añadido, puede suponer una alternativa a los usos agrícolas tradicionales y traer consigo ventajas medioambientales con respecto a la síntesis química tradicional.

La base de la mejora genética vegetal es la transferencia de información genética entre plantas con el fin de producir los fenotipos deseados. La tecnología del ADN recombinante permite la manipulación directa y altamente especifica del material genético. Las situaciones en las que las técnicas del ADN recombinante pueden resultar más valiosas son aquellas que implican la transferencia de genes únicos o de pequeños grupos de genes de un organismo a otro, cuando tal transferencia no sea posible por medios tradicionales. Además de incorporar genes de interés provenientes de otra especie vegetal, microbiana o animal, se pueden manipular in vitro los genes propios de una especie para, por ejemplo, alterar su nivel de expresión, el momento de activación, o modificar la especificidad tisular de sus productos con un fin determinado. También es posible la in activación selectiva de los genes mediante la trascripción de genes antisentido , y se esta en camino de lograr la inserción de genes de manera mas especifica con el fin de minimizar la variabilidad en la expresión génica entre los transformantes.

A continuación se recuerda -en apretada síntesis- los pasos de la producción de vegetales transgénicos.

Utilizando las enzimas de restricción se aísla el elemento responsable del efecto que desee lograrse, por ejemplo la superior resistencia a los herbicidas.

El gen se inserta en un anillo de ADN autoreplicable junto con un gen de resistencia a antibióticos con el que posteriormente se seleccionarán las plantas donde la implantación ha tenido éxito.

El anillo de ADN autoreplicable, o plásmido, se introduce en un huésped en el que se replicará utilizando enzimas del propio huésped, que puede ser un tipo de bacteria.

Los plásmidos replicados se introducen en una bacteria adecuada para "contagiar" al
tipo de planta que se desea modificar.

Estas bacterias transmiten a células de la planta, criadas en el laboratorio, el plásmido modificado, alterando el genoma del original e incorporándole las nuevas características.

Utilizando hormonas se regeneran plantas completas a partir de las células modificadas.

El tratamiento con antibióticos selecciona las plantas en las que la modificación ha tenido éxito.

Las primeras plantas que expresaron genes manipulados fueron plantas de tabaco, Nicotiana tabacum, transformadas mediante vectores de A. tumefaciens. La transformación fue confirmada por la presencia de secuencias de ADN externas en los transformantes primarios y en su progenie, y por un fenotipo de resistencia antibiótica conferida por un gen quimérico de neomicina fosfotransferasa.

Estos primeros experimentos de transformación a menudo utilizaron protoplastos como células receptoras. El posterior desarrollo de métodos de transformación basados en explantes regenerables como hojas, brotes y raíces contribuyeron significativamente a la transformación fácil y rutinaria que se usa hoy en muchas especies de dicotiledóneas, mostrándose las monocotiledóneas muy reticentes a la transformación con este sistema.

Por ello, varios métodos de transformación con ADN libre como la microinyección, electroporación, y la tecnología del disparo de partículas, han sido desarrollados con éxito para la transformación en monocotiledóneas como el may, trigo y arroz. En la actualidad mas de 50 especies de plantas cultivadas pueden ser manipuladas genéticamente por técnicas moleculares. La lista incluye prácticamente todas las dicotiledóneas mas importantes y esta aumentando rápidamente el número de monocotiledóneas. En los próximos años se prevé la puesta a punto de sistemas eficaces y rutinarios de transformación para prácticamente todos los cultivos.

Transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Los derivados del patógeno A. tumefaciens han mostrado ser vehículos eficientes y versátiles para la introducción de genes en plantas y células vegetales. Los primeros experimentos demostraron que ADN heterólogo insertado en el ADN-T podía ser transferido a las plantas junto con los genes del ADN-T ya existentes.

Se construyeron sistemas de transformación eficientes eliminando los genes de la biosíntesis de fitohormonas de la región del ADN-T, lo que terminaba con la capacidad de la bacteria para inducir proliferación celular aberrante. Los modernos vectores de transformación son capaces de replicación en Escherichia coli y en A. tumefaciens, tras las manipulaciones convenientes.

Los avances mas recientes en la tecnología de los vectores de Agrobacterium han implicado mejoras en la ordenación de genes y sitios de restricción en los plásmidos, para facilitar la construcción de nuevos vectores de expresión. Los vectores que se usan actualmente contienen regiones multilinker que pueden estar flanqueadas por un promotor y/o un sitio de adición de poliadenilato, para hacer posible la expresión directa de las secuencias codificantes insertadas.

Básicamente se emplean dos tipos de vectores desarrollados a partir del sistema A. tumefaciens - plásmido Ti: los llamados vectores de cointegración (sistemas cis) y los vectores binarios (sistemas trans). En el primer caso se clona en propio segmento ADN-T en Escherichia coli (utilizando por ejemplo el plásmido pBR322). El ADN-T del plásmido aislado se abre con enzimas de restricción adecuados, lo que permite la introducción de segmentos del ADN extraño que se desea transferir al genoma de la planta. Los recombinantes se vuelven a clonar en E. coli. Cuando estos plásmidos son introducidos por conjugación en una cepa de A. tumefaciens portadora del pTi salvaje, la precombinación homologa dentro de las células permite la transferencia del segmento de ADN-T que contiene el inserto a la región ADN-T del pTi completo. Incorporando un marcador de selección al inserto, por ejemplo el gen de resistencia a la kanamicina de E. coli, las células de A. tumefaciens portadoras del pTi recombinante pueden ser seleccionadas fácilmente.

Gráfico 2 Replicación de pTi recombinante en Agrobacterium tumefaciens.

Fuente: Lourdes Luengo (La Ravida - España)

La replicación del pTi recombinante en de A. tumefaciens, seguida de la infección a plantas, da lugar a la proliferación de células vegetales transformadas que constituyen primero un callo, y alterando de la forma adecuada las concentraciones de fitohormonas, puede regenerarse la planta transgénica completa. El vector binario aprovecha la distinción entre funciones cis y trans que existe en el plásmido. El vector básico es un plásmido lanzadera, capaz de replicarse en E. coli y en un amplio rango de otras bacterias (incluyendo de A. tumefaciens), que contiene los dos segmentos de 24 pb correspondientes a los limites del ADN-T. En E. coli , mediante procedimientos rutinarios de clonaje, se preparan derivados del vector que contienen inserciones de ADN (secuencia que se desea transferir a la planta) hacia la izquierda del segmento de 24 pb de la derecha. Estos plásmidos recombinantes son trasferidos directamente a células de A. tumefaciens de una cepa portadora del pTi de tipo salvaje (o mejor aun, de un pTi defectuoso al que se haya eliminado las secuencias de 25 pb o del segmento ADN-T completo). Los plásmidos recombinantes son capaces de replicarse en el nuevo hospedador, el cual le proporciona en trans las funciones vir requeridas para la inserción del ADN en el genoma de la planta. Las células vegetales que son posteriormente infectadas por estas bacterias recombinantes contienen copias integradas del ADN-T salvaje, del ADN-T recombinante o de ambos. En el caso de haber empleado el pTi defectuoso únicamente son trasferidos los ADN-T recombinantes lo que supone una ventaja. Si se asocia al ADN-T recombinante un gen marcador y una secuencia de regulación de la trascripción que sea activa en la planta (por ejemplo, la región 3U del gen nos ) puede expresarse el producto génico funcional correspondiente en la planta transgénica.

La Agrobacterium constituye un excelente sistema de introducción de genes en células vegetales, ya que: (i) el ADN puede ser introducido en todos los tejidos de la planta, lo que solventa la necesidad de protoplastos; y (ii) la integración del ADN-T es un proceso relativamente preciso. La región de ADN a ser transferida esta definida por las secuencias a los flancos. Ocasionalmente se producen reordenaciones, pero en la mayor parte de los casos la región se inserta intacta en el genoma de la planta. La estabilidad de la expresión de la mayoría de los genes que se introducen vía Agrobacterium es excelente. Los ADN-T integrados muestran mapas genéticos consistentes y segregaciones adecuadas. Los caracteres introducidos han mostrado ser estables durante muchas generaciones de cruzamientos en plantas manipuladas por estas técnicas. Esta estabilidad es critica de cara a la comercialización de plantas transgénicas. La lista de especies que pueden ser transformadas por Agrobacterium se amplia día a día, y en el momento presente incluye a bastantes de los cultivos mas importantes, exceptuados los cereales.

Pocas monocotiledóneas parecen ser hospedadores naturales de Agrobacterium, aunque se han obtenido plantas transgénicas en espárragos con vectores Agrobacterium y se han observado tumores transformados en la batata. Cereales de grano como el arroz, may y trigo no han sido transformados de forma estable con Agrobacterium, a pesar de la evidencia de transferencia de T-ADN en may, trigo y cebada. Por ello se han realizado esfuerzos extensivos para conseguir tecnologías de transformación alternativas en estas especies.

Vectores virales y agro infección.

Los virus ADN de plantas han recibido bastante atención como posibles vectores para la introducción de genes en las plantas.

Se ha demostrado la propagación y expresión de genes bacterianos, seleccionables como marcadores, trasferidos a plantas por el virus del mosaico de la coliflor, CaMV. También se han combinado las capacidades de los plásmidos derivados del Ti y de los vectores virales en una técnica llamada RagroinfeccionS: ADN vírico o copias ADNc del ARN vírico se introducen en plantas mediante plásmidos Ti de Agrobacterium, resultando una infección vírico sistémica en la planta transgénica. Para la liberación del virus no es necesario que el ADN-T se integre en el genoma de la planta. La infección sistémica no es prueba de integración del ADN externo. Sin embargo, en caso de producirse la integración, la agro infección conduce a la transformación de las células adyacentes a la herida y, en consecuencia, a la posible obtención de plantas transgénicas.

Los virus ARN como el virus del mosaico del tabaco TMV, que replican solo a través de intermediarios ADN, pueden también ser utilizados como vectores en ingeniería genética de plantas. Los vectores virales proporcionan algunas ventajas teóricas para la introducción de genes en plantas, como son la facilidad de la infección, el rango de hospedadores mas amplio al de Agrobacterium, y el alto cociente entre el numero de copias y la expresión de genes insertados bajo el control de los promotores apropiados. Sin embargo existen de hecho limitaciones importantes:

el tamaño máximo del ADN pasajero que no afecta a la infectividad vírico parece estar limitado;

las infecciones virales generalmente provocan síntomas específicos de enfermedad o son letales para la planta huésped;

posiblemente, la alta frecuencia de errores durante la síntesis del ARN vírica puede dar lugar a la expresión incorrecta del gen introducido; y, la mas importante;

el ADN externo no se transfiere necesariamente a la descendencia. De acuerdo con las evidencias disponibles, los virus no se integran en el genoma de la planta hospedadora, y no aparecen en los meristemos de la planta por lo que no se transmiten a la descendencia por vía sexual. Parece muy difícil (excepto, v.gr., a través de elementos transponibles) el uso de vectores virales para la transformación genética de plantas. pero tienen un buen potencial para la amplificación génica y la infección sistémica en plantas individuales.

Se han propuesto otros vectores posibles para la transformación genética en células vegetales, tales como elementos transponibles, elementos mitocondriales del may, componentes geonómicos nucleares, y viroides y virusoides, que, por el momento, no han mostrado eficiencia.

Transferencia directa de genes.

El desarrollo de estos métodos se hizo inspirándose en las técnicas físicas usadas en la transformación de células animales en cultivo. Así se ha conseguido la transformación de protoplastos de plantas facilitando la entrada de ADN por precipitación con fosfato cálcico, tratamiento con PEG, electroporación, o la combinación de varios de estos tratamientos. Tales métodos han posibilitado la producción de células transgénicas para estudios de expresión génica en sistemas que no pueden ser transformados por otras técnicas. La aplicación de estas técnicas a la producción de plantas transgénicas esta limitada por las dificultades inherentes a la regeneración de plantas a partir de protoplastos.

Ha habido considerables avances en la regeneración de cereales, tradicionalmente uno de los grupos mas recalcitrantes. Varios laboratorios han tenido éxito en la regeneración de plantas fértiles de arroz a partir de protoplastos de embriones. Este avance fue inmediatamente seguido por la producción de plantas transgénicas de arroz, a través de la descarga de ADN libre en protoplastos y posterior regeneración de la planta, primero en variedades Japónica y recientemente en una variedad Indica (la mas importante como fuente de alimento en el mundo). Se han obtenido plantas transgénicas fértiles a través de técnicas de electroporación de embriones inmaduros y de calli, también en líneas comerciales.

En paralelo al trabajo de transformación de protoplastos se han realizado esfuerzos para encontrar nuevas vías de introducir ADN en células intactas o tejidos. La regeneración de cereales a partir de embriones inmaduros o de explantes es relativamente una rutina. Uno de los avances mas significativos en este arrea ha sido la introducción de la tecnología de los micro proyectiles de alta velocidad. En este sistema el ADN se carga sobre una superficie de pequeñas partículas de metal (0+5 a 5 micras) que son aceleradas a velocidades de uno a varios centenares de metros por segundo. Las partículas son capaces de penetrar a través de varias capas de células y realizan la transformación celular en tejidos de explantes. Se han obtenido plantas transformadas estables de tabaco y soja mediante disparo de partículas y, mas recientemente, plantas transgénicas fértiles de may, arroz, trigo y avena mediante bombardeo de cultivos embrionarios y de embriones cirróticos inmaduros. Gracias a la eliminación del paso por el estado de protoplastos, el método del disparo tiene el potencial de permitir la transformación directa de genotipos comerciales de cereales. Una desventaja de los sistemas de transferencia directa es la frecuente aparición de reordenaciones y reacciones de concatenación antes de la inserción del gen, lo que determina un patrón de integración bastante impredecible.

Protoplastos y transferencia directa de genes.

Los protoplastos incorporan eficazmente ADN del medio si se les trata con polietilenglicol (PEG) y/o electroporación. El propio proceso de aislamiento de protoplastos probablemente induce la formación de células competentes en el estado adecuado. Si se dispone de poblaciones de protoplastos que contengan células competentes, el ADN exógeno es integrado fácilmente vía precombinación no-homologa. Tambien puede ocurrir precombinación homologa pero a un nivel mas bajo.

Cuando se transforman protoplastos capaces de regeneración, pueden obtenerse plantas transgénicas que contienen, expresan y heredan de forma estable el gen extraño. En cereales, solo se han aislado protoplastos competentes a partir de suspensiones embriogénicas establecidas a partir de tejidos inmaduros (escutelo, base de la hoja, antera). Los procedimientos standard de transferencia de genes con protoplastos han conducido a la regeneración de varios cereales transgénicos (arroz, may). El cultivo de protoplastos aislados a partir de diferentes tejidos es útil en los análisis de la expresión transitoria de un gen o de una secuencia reguladora, ya que la incorporación del ADN a esos protoplastos no es problemática. La integración, en caso de producirse, no tiene consecuencias, ya que los protoplastos de este origen no proliferan.

La fusión de protoplastos, mediada por varios agentes fusógenos como el PEG, es un buen método para la generación de híbridos ínter específicos. El ADN-T de Agrobacterium y otras secuencias de ADN puede ser transferidas de una especie a otra por medio de la fusión de protoplastos y esferoplastos. Con el desarrollo de los marcadores adecuados, la fusión de protoplastos supone una vía de control del intercambio de genes entre especies, por medio de la cotransferencia de estos con genes marcadores seleccionables derivados del vector.

Fusión de liposomas con tejidos y protoplastos.

Entre los distintos métodos para introducir ADN aislado en protoplastos y tejidos de plantas superiores, la transferencia directa de genes mediada por liposomas es uno de los mas difíciles. Si bien en un principio el método mostró ser eficaz, solo ha recibido una atención muy limitada.

Los problemas radican en la preparación de los liposomas y en la encapsulación de los plásmidos. Estos problemas quedan en parte soslayados con la reciente disponibilidad comercial de preparaciones de liposomas estables (Lipofectina), que espontáneamente se unen al ADN y median en su descarga dentro de la célula. La eficacia del método aumenta al combinarlo con otras técnicas como el tratamiento con PEG o la electroporacion. La descarga de ADN y otras macromoléculas en protoplastos vegetales mediante diferentes tipos de liposomas ha sido el objetivo de muchos experimentos, habiéndose conseguido en primer lugar la integración de ADN exógeno en el genoma de may y de tabaco.

Los métodos de transferencia mediados por liposomas poseen algunas ventajas con respecto a la transferencia directa de ADN, como son la proteccion contra las nucleasas que proporciona la membrana y la no necesidad de un ADN transportador (carrier). Por contra, la breve sonicacion necesaria para la inclusión del ADN en los liposomas puede producir rupturas y daños. Pese a su dificultad, el método de fusión de liposomas que contienen ADN con protoplastos esta actualmente bien asentado en la producción de plantas transgénicas de bastantes especies. Menos exitosa ha resultado la fusión de los liposomas con tejidos y células normales.

Disparo de partículas o Biolística.